食管癌是常见恶性肿瘤之一,占全球恶性肿瘤死亡的第六位。多数食管癌确诊时期别较晚,已失去手术机会。放射治疗为中晚期食管癌主要治疗方法,因半数以上的食管癌在治疗过程中需接受放疗。然而,单纯放疗后5年生存率仅为10³0%,肿瘤局部未控率和复发率高达80%。因此,提高食管癌细胞的放射敏感性,减少局部复发、改善生存期仍是研究的热点。自Thomlison和Gray发现恶性肿瘤内存在乏氧细胞50多年以来,临床上已有许多证据表明,肿瘤乏氧细胞的产生和存在不仅使肿瘤对放化疗的抗拒性增加,而且使肿瘤更具有侵袭性,容易发生转移。随着分子生物学等技术的发展,人们对缺氧导致的肿瘤细胞适应性变化及相关的一系列病理生理过程有了一定的认识。目前研究表明,缺氧引起的肿瘤对放化疗抗拒性增加及肿瘤自身侵袭增强的机制主要有以下几个方面:①缺氧能特异抑制S期肿瘤细胞的DNA复制的启动。当S期细胞再氧合时,引起DNA过度复制,一方面引起肿瘤细胞放射抗拒基因的扩增使肿瘤对放射治疗的抗拒性增加,另一方面引起肿瘤细胞染色体的畸变和重组,导致肿瘤的异质性增加,如基因的不稳定性、有氧糖酵解、细胞周期失控和正常凋亡信号的丢失。②肿瘤内缺氧-再氧合过程能产生氧来源的自由基,其中氢氧自由基能增加基因的不稳定性,造成基因突变,使肿瘤细胞的基因变成更具有侵袭性的表型。③缺氧存在能使肿瘤细胞的一些基因和蛋白的合成或表达增加,包括血管内皮生长因子（VEGF）、促红细胞生成素（EPO）、p53和血小板源性生长因子β（PDGFβ）等。这些酶或因子的变化使肿瘤细胞在适应缺氧微环境的同时,引起肿瘤自身侵袭性增加和对放化疗的抗拒性增加。研究表明,缺氧诱导因子-1（HIF-1）在这个过程中起着中枢纽带作用。HIF-1最先于1992年在缺氧诱导的细胞核抽提物中发现。它是异源二聚体转录因子,由HIF-1α和HIF-1β两种亚基聚合而成,两亚基均属于碱性环-螺旋-环（bHLH）结构家族。到目前为止,已确定HIF-1的靶基因超过70个,它们具有许多生物学效应,包括血管形成、细胞生存、细胞凋亡、红细胞生成、转录调节、药物抵抗,能量代谢和pH值的调节等。HIF-1的活性由HIF-1α决定,HIF -1α在常氧下被蛋白酶降解,在缺氧下可以保持稳定。研究证明,HIF -1α在多种肿瘤中高表达,且与肿瘤血管形成有关。因此,抑制HIF-1α蛋白表达,可有效地增加肿瘤细胞放化疗的敏感性。RNAi技术是近年来发现的反义基因技术,自1998年Fire等首次发现RNAi现象以来,迅速应用于基因功能、病毒等方面的研究。RNAi技术是将目的基因所对应的小分子双链RNA,（21²5 nt的正义和反义RNAs链,即小干扰RNA）导入生物体,导致相应的mRNA降解,从而阻断哺乳动物细胞中特定基因的表达。在食管癌细胞和食管癌组织中,HIF-1α、VEGF表达情况如何、与细胞放射敏感性的关系,报道不多。本研究首先观察食管癌细胞、食管癌组织以及正常食管粘膜组织中HIF-1α、VEGF表达情况,并了解HIF-1α、VEGF表达与食管癌发生、发展以及单纯放疗疗效的关系;其次,观察体外CoCl2诱导缺氧对食管癌细胞中HIF-1α、VEGF表达、细胞周期变化以及放射敏感性的影响;最后,在CoCl2诱导缺氧条件下通过脂质体介导、质粒连接HIF-1α短发卡状RNA（shRNA）的RNA干扰（RNAi）技术,探讨食管癌细胞转染前后,对HIF-1α、VEGF表达的变化以及照射后细胞周期的影响,并进一步探讨shRNAi HIF-1α对食管癌细胞Eca109放射敏感性的影响。第一部分食管癌细胞和食管癌组织中HIF-1α、VEGF的表达及其临床意义目的:观察食管癌细胞、食管癌组织以及正常食管粘膜组织中HIF-1α、VEGF的表达情况,了解食管癌组织中HIF-1α、VEGF表达及其与单纯放疗疗效的关系。方法:人食管癌细胞株Eca109细胞中,采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测HIF-1α、VEGF mRNA表达,western blottin检测HIF-1α、VEGF蛋白表达。收集50例放疗前食管镜活检诊断为食管鳞状细胞癌的肿瘤组织标本,同时收集正常食管粘膜组织标本10例,应用免疫组化SP法检测组织标本中HIF-1α、VEGF蛋白表达,并分析单纯放疗疗效及预后相关因素。结果:⑴Eca109食管癌细胞中HIF-1α、VEGF的mRNA和蛋白均有表达。50例食管癌组织中HIF-1α蛋白高表达者34例,表达率68.0%;VEGF蛋白高表达者37例,表达率74.0%,HIF-1α和VEGF蛋白表达与临床分期有关,分期越晚,表达越高。而正常食管粘膜组织未见HIF-1α、VEGF蛋白表达。⑵50例食管鳞癌患者放疗后CR16例、PR26例,总有效率（CR+PR）为84.0%（42/50）,放疗后1、2、3年生存率分别为76%、52%、27%,中位生存期13个月。单因素分析显示:X线食管造影病变长度、周围组织受侵、淋巴结转移、远处转移、临床分期、HIF-1α和VEGF蛋白表达与放疗预后均有关,p值<0.05;COX多因素分析患者性别、年龄、肿瘤生长部位、病理分化程度（中、高、低分化鳞癌）及肿瘤组织中VEGF蛋白表达等均与预后无关,p值均>0.05,仅临床分期、HIF-1α为独立预后因素。HIF-1α蛋白表达阳性和阴性组放疗后完全缓解率、中位生存时间分别为8.8%、10个月和81.3 %、25个月;1、2、3年生存率分别为38.2%、6.0%、2.9%和81.3%、54.2%、15.8%, Log-Rank检验两组生存曲线差异有非常显著性意义（P=0.001）。结论:食管癌细胞、食管癌组织中均有HIF-1α、VEGF蛋白表达。HIF-1α和VEGF蛋白表达与食管癌临床分期有关,分期越晚,表达越高。临床分期和HIF-1α是影响食管癌单纯放疗疗效的主要因素。第二部分CoCl2缺氧诱导Eca109细胞产生放射抗拒性机制的研究目的:观察CoCl2诱导缺氧及缺氧加照射条件下,食管癌细胞系Eca109的细胞周期变化、以及HIF-1α和VEGF表达的变化,同时观察缺氧对放射敏感性的影响。方法:建立食管癌细胞体外缺氧模型:食管癌细胞系Eca109于含10%的小牛血清DMEM培养基（370C,5%CO2孵箱）中培养,不同浓度（0、50、100、150、200μmol/L）化学缺氧剂CoCl2,用于模拟肿瘤内部缺氧微环境,MTT法观察细胞的增殖活性。半定量RT-PCR方法检测CoCl2150μmol/L缺氧培养不同时间（0h、8h、16h、24h） HIF-1α和VEGF mRNA的转录水平,免疫印迹（Western blot）检测HIF-1α和VEGF蛋白表达情况。流式细胞仪检测缺氧培养及缺氧合并照射细胞周期及凋亡的变化。克隆实验检测缺氧24小时Eca109食管癌细胞的放射敏感性的变化。结果:（1）随着CoCl2浓度的增加（0、50、100、150、200μmol）, MTT测定Eca-109细胞的增殖情况,发现Eca109细胞的增殖活性逐渐减慢（P﹤0.05）。⑵缺氧处理一定时间后（0h、8h、16h、24h）, RT-PCR检测结果显示,正常氧培养条件下食管癌Eca109细胞VEGF蛋白也有表达,随着缺氧时间延长,HIF-1αmRNA的表达没有明显改变（P>0.05）。而VEGF mRNA的转录在缺氧培养后显著升高,且变化存在显著性差异（P<0.05）。⑶western blotting检测结果显示,食管癌Eca109细胞系在正常氧条件下HIF-1α蛋白仅有少量表达,缺氧处理后,HIF-1α蛋白表达显著提高,与缺氧时间呈现正相关,缺氧24小时组表达最高,而且主要表达在细胞核;正常氧培养条件下食管癌Eca109细胞VEGF蛋白也有表达,缺氧处理后,VEGF蛋白表达量增加。与对照组相比,缺氧8、16、24小时后, VEGF蛋白表达均有提高,且变化存在显著性差异（P<0.05）。⑷流式细胞术检测发现CoCl2诱导缺氧可引起Eca109G0/G1期细胞阻滞,降低S期细胞阻滞,与各组相比,缺氧24小时组S期细胞最少（P<0.05）;而对G2/M期、凋亡影响不大（P>0.05）。单纯照射与缺氧加照射相比,缺氧加照射增加G0/G1期阻滞、降低了G2/M期阻滞、凋亡增加（P<0.05）。相关性分析表明:HIF-1α与VEGF蛋白表达呈正相关关系（r=0.989,P=0.000） ;缺氧条件下HIF-1αmRNA和HIF-1α蛋白表达与G0/G1期阻滞呈正相关关系（r=0.930, P=0.000）。⑸克隆形成实验检测正常氧和缺氧环境培养的Eca109食管癌细胞株的放射敏感性。结果显示正常氧和缺氧24小时组的Eca109细胞的存活分数分别为96.33%、和97.33%;照射4Gy后,缺氧加放射组、单纯放射组细胞存活分数分别为48.3%和21.7%,存在显著性差异（P<0.05）。正常氧组和缺氧24小时组Eca109细胞的D₀值分别为2.44Gy和2.48Gy。提示缺氧24小时对Eca109细胞的存活无明显影响（P>0 05）,然而缺氧状态下Eca-109细胞放射敏感性降低。结论:Eca109食管癌细胞缺氧处理后,HIF-1α仅蛋白表达上调,而VEGF mRNA和蛋白水平表达均上调。G0/G1期细胞阻滞, S期细胞减少,放射敏感性降低。第三部分RNA干扰HIF-1α对食管癌细胞Eca109 HIF-1α、VEGF表达及放射敏感性的影响目的:CoCl₂模拟缺氧环境,观察shRNA干扰（shRNAi）HIF-1α后,食管癌细胞中HIF-1α、VEGF表达及干扰照射后细胞周期和凋亡的变化和shRNA转染对细胞放射敏感性的影响。方法:⑴设计合成针对HIF-1α基因的短发卡状RNA（shRNA ）与pSilencer 2.1-U6 neo真核表达载体,经DH5α大肠杆菌转化、克隆挑选与扩增、质粒DNA测序鉴定;⑵将插入完全正确的转化细菌重新放大培养后,分别提取质粒DNA;⑶按照LipofecteminTM2000转染说明将重组质粒和阴性对照质粒DNA转染食管癌Eca109细胞,并于CoCl2150μmol/L诱导的缺氧条件下培养24h;⑷采用RT-PCR检测HIF-1α和VEGFmRNA转录水平、western blotting检测HIF-1α和VEGF蛋白表达、流式细胞术检测5Gy照射后细胞周期变化,克隆形成实验检测细胞的放射敏感性。结果:⑴重组质粒测序分析证实已成功地将HIF-1αshRNA与pSilencer 2.1-U6 neo真核表达载体连接、并经细菌转化扩增后,提取质粒DNA;⑵shRNA转染HIF-1α24小时后RT-PCR检测显示,以HIF-1α基因cDNA序列设计的2条shRNA（HIF-1α-sh1、HIF-1α-sh2）转染Eca109细胞,Eca109细胞中HIF-1α和VEGFmRNA表达均明显地降低（P﹤0.05）。Western blotting检测显示,以HIF-1α基因cDNA序列设计的shRNA（HIF-1α-sh1）转染Eca109细胞,Eca109细胞中HIF-1α和VEGF蛋白表达均明显地降低（P﹤0.05）。⑶HIF-1αshRNA转染对细胞周期及凋亡影响不明显（P﹥0.05）。与单纯照射组相比,HIF-1αshRNA转染加照射组G2/M期比例明显增加,G0/G1期比例明显降低;而单纯照射只增加细胞的凋亡（p﹤0.05）。⑷克隆形成实验结果显示:Eca109细胞在单纯4Gy照射和HIF-1αshRNA转染加4Gy照射后细胞存活率分别为47%和23.53%,转染后照射细胞存活率明显降低。单纯照射、阴性质粒转染照射、HIF-1α-sh1和HIF-1α-sh2转染照射的D0值分别为2.48Gy、2.14 Gy、1.82 Gy和1.61Gy,提示HIF-1αshRNA转染增加了Eca109食管癌细胞株的放射敏感性。结论:质粒连接HIF-1αshRNA转染Eca109细胞后,其HIF-1α和VEGFmRNA和蛋白表达均明显被抑制; HIF-1αshRNA转染加照射明显降低照射后G0/G1期阻滞,增加G2/M阻滞,增加细胞的放射敏感性。