细菌胞外多糖具有多种重要的生物学功能,在人类疾病的预防和治疗等方面具有许多应用而引起人们的广泛注意。葡萄糖醛酸是许多细菌胞外多糖的重要组成成分,对细菌胞外多糖的形态形成、结构稳定、功能发挥等方面起重要作用。由于葡萄糖醛酸结构的特殊性(6位碳原子有自由羧基),使得化学法合成含有葡萄糖醛酸的细菌胞外多糖比较困难,并且生物来源的细菌胞外多糖的结构具有不均一性。因此,体外酶法合成含有葡萄糖醛酸的细菌胞外多糖及其重复单元成为化学合成方法的有效补充途径,也是目前研究热点。葡萄糖醛酸转移酶在含有葡萄糖醛酸的细菌胞外多糖的合成过程中至关重要,目前对其研究较少。其中,大肠杆菌K4菌株来源的软骨素聚合酶(K4CP)是一种具有葡萄糖醛酸转移酶活性和乙酰氨基半乳糖转移酶活性的双功能糖基转移酶。因此,本课题以K4CP为工具酶,进行体外酶法合成含有葡萄糖醛酸的细菌胞外多糖重复单元的研究。以期为研究葡萄糖醛酸转移酶、体外酶法合成含有葡萄糖醛酸的细菌胞外多糖及其重复单元和衍生物打下基础。第一,本课题成功表达了大肠杆菌K4菌株来源的K4CP酶。据文献报道N端缺失前57个氨基酸的K4CP酶(K4CP△57)同样具有葡萄糖醛酸转移酶活性。因此,本课题构建了 K4CP-pET-28a(+)和K4CPA57-pET-28a(+)表达载体,测序正确后转化至BL21(DE3)细菌中诱导表达。SDS-PAGE和Western-blot分析结果证明了目的蛋白的表达。第二,我们对表达的K4CP酶和K4CP△57酶进行了纯化。经镍离子亲和层析纯化和超滤浓缩纯化后,SDS-PAGE检测结果显示K4CP酶和K4CP△57酶的纯度均高达90%以上。通过BCA法检测结果显示K4CP酶和K4CP△57酶的表达量分别为3 mg/L和110 mg/L。第三,本课题研究了 K4CP酶和K4CP△57酶的活性。K4CP酶和K4CP△57酶都能够以透明质酸六糖作为底物,利用UDP-乙酰氨基半乳糖作为糖供体,将乙酰氨基半乳糖连接至透明质酸六糖上,分别生成相应的七糖产物。向上述反应体系中加入UDP-葡萄糖醛酸,分别生成相应的八糖产物。说明本研究表达的K4CP酶和K4CP△57酶都具有葡萄糖醛酸和乙酰氨基半乳糖转移酶活性。第四,本课题研究了 K4CP酶和K4CPA57酶的底物特异性。对K4CP酶受体底物特异性的研究结果显示,该酶能够识别透明质酸四糖、透明质酸六糖、肺炎链球菌3型荚膜多糖重复单元相关六糖衍生物(NH2-6)和肺炎链球菌3型荚膜多糖重复单元相关七糖衍生物(NH2-7)。对K4CP酶糖供体底物特异性的研究结果显示,该酶能够识别UDP-乙酰氨基半乳糖、UDP-乙酰氨基葡萄糖和UDP-葡萄糖醛酸。对K4CPA57酶受体底物特异性的研究结果显示,该酶能够识别透明质酸六糖、NH2-6和NH2-7。对K4CP△57酶糖供体底物特异性的研究结果显示,该酶能够识别UDP-乙酰氨基半乳糖和UDP-葡萄糖醛酸。第五,本课题利用K4CP酶体外合成了 NH2-7。K4CP酶以2.5 mg NH2-6为底物,以UDP-乙酰氨基半乳糖为糖供体反应结束后,纯化得到1.52mg产物,产率为51.25%。ESI-MS和核磁共振分析结果表明分离纯化得到的产物为NH2-7。通过本课题的研究,说明了体外表达的K4CP酶和K4CP△57酶可用于体外酶法合成含有葡萄糖醛酸的低聚糖,为下一步体外酶法合成细菌胞外多糖重复单元衍生物以及细菌胞外多糖打下基础。