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第一部分胰岛素对新生大鼠缺氧后复氧心肌细胞损伤影响及细胞凋亡信号转导机制研究第一节新生大鼠体外心肌细胞培养和缺氧／复氧模型建立目的：通过体外培养新生大鼠心肌细胞，构建新生大鼠心肌缺氧／复氧损伤模型，在细胞水平模拟大鼠心肌缺血再灌注(SI／R)损伤，为研究胰岛素对新生大鼠缺氧／复氧损伤影响提供平台。方法：分离新生1-3天的乳鼠心室肌，在培养基中培养3-4天后，行缺氧2h／复氧4h，建立缺氧／复氧(anoxia／reoxygenation)心肌细胞损伤模型。在缺氧前、缺氧2h末期和复氧4h末期利用2，4二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛(MDA)含量并进行比较，以证实缺氧／复氧损伤模型构建成功。结果：新生1-3天的乳鼠心室肌，在培养基中培养3-4天后，在倒置显微镜下可观察到有搏动的心肌细胞。培养3-4天的心肌细胞在实施缺氧期2h后，LDH和MDA均较缺氧前有所升高(P＜0.01)；而给予复氧期4h后，LDH和MDA明显高于缺氧期(P＜0.01)，对照组的上述指标在相应时间点未见明显改变(P＞0.05)。结论：通过给新生大鼠体外培养心肌细胞行缺氧2h／复氧4h后，可明显造成心肌细胞损伤，以此模拟大鼠心肌缺血再灌注损伤。第二节胰岛素对新生大鼠缺氧后复氧诱导心肌细胞凋亡、Akt表达影响及机制研究目的：通过新生大鼠缺氧／复氧损伤模型，观察胰岛素对新生大鼠缺氧后复氧诱导心肌细胞凋亡、Akt的影响，探讨其信号转导机制。方法：通过给原代培养乳鼠心室肌细胞行缺氧2h／复氧4h，建立缺氧／复氧(anoxia／reoxygenation)心肌细胞损伤模型。于复氧期开始分别给予0.9％生理盐水(VC组)、胰岛素(INS组)、LY294002(LY组)、胰岛素+LY294002(INS+LY组)干预。于复氧4h后，利用2，4二硝基苯肼显色法检测乳酸脱氢酶(LDH)活性，硫代巴比妥酸显色法检测丙二醛(MDA)含量，原位末端标记法(TUNEL)和DNA梯带法(DNA Ladder)标测细胞凋亡，免疫印迹法(Western blotting)检测磷酸化Akt表达，并比较各组间差异。结果：与VC组相比，INS组中LDH活性、MDA含量、凋亡指数(AI)显著降低(P＜0.01)，磷酸化Akt表达明显增加(P＜0.01)；但上述指标变化可被LY294002(PI3K抑制剂)所抑制。结论：在复氧早期给予胰岛素干预可显著地减少缺氧后复氧所诱导的心肌细胞凋亡，其保护机制与PI3K／Akt信号通路所介导的抗细胞凋亡作用有关。第二部分胰岛素对大鼠缺血后再灌注心肌保护作用及其与GIK比较研究目的：通过比较胰岛素和极化液(GIK)对大鼠缺血后再灌注心肌LDH、MDA、IS／AAR％以及LVEDP的影响，探讨胰岛素在GIK成分中的作用以及调节代谢以外的保护机制。方法：结扎SD大鼠左冠状动脉前降支(LAD)30min，复灌LAD180min，建立大鼠缺血再灌注模型，将58只SD雄性大鼠随机分组为：缺血期组(I组，12只)，缺血再灌注组(I／R组，12只)，假手术组(SHAM组，10只)，胰岛素处理组(INS组，12只)，GIK处理组(GIK组，12只)。假手术组给予冠脉穿线(不结扎)；缺血期组给予缺血30min，不给予再灌注；其它组分别在再灌注前5min给予生理盐水、胰岛素、GIK干预。用硫代巴比妥酸显色法检测心肌组织中丙二醛(MDA)含量；用2，4二硝基苯肼显色法检测血浆中乳酸脱氢酶酶(LDH)活性；用TTC染色检测心肌梗塞范围(IS／AAR％)；检测左室舒张末压(LVEDP)评价心功能并进行组间比较。结果：1)I／R组中MDA值、LDH值、IS／AAR％和LVEDP均明显高于I组(P＜0.01)；2)与I／R组相比，INS组和GIK组均可明显降低MDA值(P＜0.01)、LDH值(P＜0.01)，减少心肌IS／AAR％(P＜0.05)，降低LVEDP(P＜0.05)；3)上述指标在INS组和GIK组间未见统计学差异。结论：1)大鼠心肌缺血后再灌注可导致MDA值、LDH值、IS／AAR％和LVEDP升高；2)胰岛素在缺血后再灌注损伤中可能具有一定的抗氧化作用；3)胰岛素抗心肌缺血后再灌注损伤作用可能不完全依赖于对能量代谢的调节。第三部分胰岛素对大鼠缺血后再灌注心肌细胞凋亡、Bad表达影响及机制研究目的：观察胰岛素对大鼠缺血后再灌注心肌细胞凋亡及促凋亡蛋白Bad磷酸化表达的影响，以进一步探讨胰岛素在缺血再灌注损伤中的抗凋亡机制。方法：46只SD雄性大鼠随机分为四组：1)缺血再灌注对照组(I／R，n=12只)，实施30min缺血／180min再灌注；2)胰岛素组(INS，n=12只)，于再灌注期前5min颈静脉内输注胰岛素(60U／L，4ml／kg.h)至灌注期结束；3)胰岛素+LY294002组(INS+LY，n=12)，再灌注前10min静脉注射LY294002(0.3mg／kg)，5min后再静脉输注胰岛素+LY294002(30ug／kg／hr)；4)假手术组(SHAM，n=10只)：仅给予冠脉穿线，不实施结扎。实验结束后，用原位末端标记法(TUNEL)和DNA梯带法(DNA Ladder)标测细胞凋亡，用免疫组化和Westem-blotting法检测磷酸化Bad(pBad)表达。结果：1)与SHAM组相比，I／R组凋亡指数(AI)明显增加(P＜0.01)，pBad表达降低(P＜0.05)；2)与I／R组相比，INS组AI值明显减少(P＜0.01)，pBad表达升高(P＜0.01)；3)与INS组相比，INS+LY组AI值明显增加(P＜0.01)，pBad表达降低(P＜0.05)。结论：1)缺血再灌注可导致心肌组织pBad低表达；2)胰岛素对大鼠在体缺血再灌注心肌有明显抗凋亡作用；3)PI3K／Akt／Bad途径可能为胰岛素抗缺血再灌注诱导心肌凋亡的重要信号转导机制，其机制可能与胰岛素通过PI3K／Akt途径减少pBad表达有关。