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目的:研究清肺化痰汤对抗COPD过程中的机制,证明清肺化痰汤在对COPD的反复发作的治疗过程中,其治疗效果与其能抗黏液的高分泌有密切的关系。以此来揭示清肺化痰汤抗黏液高分泌的机制,期望能够给临床上COPD的治疗及防治工作提供新的方法和策略,减轻病人的痛苦与负担。方法:在动物实验部分中,我们运用了烟雾吸入联合LPS灌肺复合素的方法,建立COPD大鼠模型,造模成功后,采用给大鼠灌胃不同剂量(低、中、高三组)的清肺化痰汤的治疗方法,并设有阳性药(盐酸氨溴索)形成对比,来探索清肺化痰汤对COPD大鼠模型的治疗效果。其方法包括:1通过用大鼠肺呼吸测定仪测定各组大鼠的PIF(吸气气流高峰流速)、PEF(呼气气流高峰流速)、EF50%(呼出50%气量时流速)、MV(每分钟通气量)值这四项肺功能指标,探究清肺化痰汤对COPD大鼠模型肺功能的影响;2通过观察各组大鼠完整肺部的大体外观的体积及颜色等变化,来探索清肺化痰汤对COPD大鼠模型肺大体外观的影响;3采用HE染色法探索清肺化痰汤治疗后COPD大鼠模型肺组织的病理变化;4采用AB-PAS染色法观察各组大鼠肺组织及肺组织小气道的病理切片,探究清肺化痰汤治疗后的COPD大鼠模型,其对大鼠肺组织气道中杯状细胞增生有何影响;5通过透射电镜法来观察各组大鼠肺组织细胞的超微结构,探索清肺化痰汤对COPD大鼠模型肺组织细胞的超微结构有何改变;6采用real time-PCR法和免疫组织化学法来评估各组大鼠肺组织中MUC5AC的mRNA和蛋白的表达情况,探索清肺化痰汤对COPD大鼠模型肺组织中MUC5AC表达的影响。在细胞实验部分,通过MTT法,筛选出了LPS诱导NCI-H292细胞产生炎症的适宜浓度;通过免疫细胞化学法,筛选出了LPS诱导NCI-H292细胞产生炎症的最佳时间;在上述筛选所得的LPS的刺激浓度与时间为基础,采用免疫细胞化学法和RT-PCR法,测定在给予清肺化痰汤治疗后,测定LPS诱导NCI-H292细胞中MUC5AC的mRNA和蛋白表达的变化,来探索清肺化痰汤含药血清对LPS刺激诱导下的NCI-H292细胞的影响效果;通过Weston-blot法测定经过LPS刺激后的NCI-H292细胞内EGFR信号表达的变化,对比给予清肺化痰汤含药血清干预后细胞内EGFR表达的变化,探索清肺化痰汤在治疗COPD时,调节MUC5AC表达所经过的信号通路。结果:在动物实验部分;1.造模动物的肺呼吸功能相对空白对照组大鼠的PIF(吸气气流高峰流速)、PEF(呼气气流高峰流速)、EF50%(呼出50%气量时流速)、MV(每分钟通气量)值是明显降低,模型组大数肺功能明显下降;而清肺化痰汤治疗后的各组大鼠有明显好转。2.造模动物的肺组织大体变化明显,模型组与空白对照组相比,模型组肺大体外观明显有肺气肿、炎症及细胞纤维化等病变表征。如模型组的肺组织体积明显增大,肺组织表明出现褶皱坍陷等现象,均反映出模型组大鼠明显的病变情况。清肺化痰汤各组肺大体外观病变表征有所改善。3.HE染色后可看出模型组大鼠的肺组织中出现肺泡大量融合,细胞大量纤维化,并伴有严重的炎症。而清肺化痰汤各组有明显改善,可看到各给药组肺泡融合明显减少。说明清肺化痰汤对COPD大鼠模型产生的病变有明显的治疗作用。4通过AB-PAS染色,正常对照组的大鼠肺组织气道内杯状细胞少,黏液产生也少。而相对正常对照组大鼠而言,模型组大鼠的肺组织气道中杯状细胞的增生明显,气道管壁变厚,使得并伴随产生大量黏大量黏液堵塞气道,而清肺化痰汤低、中、高各给药组杯状细胞增生程度不大(不明显)。5通过透射电镜观察各组大鼠肺组织细胞的超微结构变化。结果显示清肺化痰汤对COPD大鼠模型的肺组织细胞超微结构损伤同样具有一定的改善作用。6实时荧光定量方法(RT-PCR)测定了各组大鼠肺组织中MUC5AC的mRNA的表达变化,发现相对正常对照组,模型组大鼠肺组织中MUC5AC的基因表达明显上调,而清肺化痰汤各治疗组MUC5AC的表达式明显有所回落的,说明清肺化痰汤在治疗COPD中,可能是通过调节MUC5AC的的表达来实现的。7免疫组织化学法观察COPD大鼠肺组织中MUC5AC蛋白的表达变化,发现相对正常对照组,模型组大鼠的MUC5AC蛋白表达也明显增强,而清肺化痰汤各组随着剂量的升高,MUC5AC蛋白的表达明显减弱。在细胞实验部分中:8.采用MTT法筛选LPS诱导NCI-H292细胞产生炎症的刺激浓度,结合实验结果及文献资源,确定刺激浓度为10ug/ml;9采用免疫细胞化学法筛选RT-PCR法LPS诱导NCI-H292细胞产生炎症的刺激时间,结合实验结果以及文献资源两方面考虑,我们选定了LPS的合理刺激时间为24小时;采用免疫细胞化学法和RT-PCR法测定经过LPS刺激后的NCI-H292细胞中MUC5AC蛋白和mRNA的表达.相对空白对照组而言,LPS刺激后的细胞MUC5AC蛋白和mRNA的表达均明显增强,而添加了清肺化痰汤含药血清的各组细胞,MUC5AC蛋白和mRNA的表达相对模型组而言明显降低。证明清肺化痰汤在治疗COPD的过程中是通过抑制MUC5AC的表达来实现的。10.通过Weston-blot法测定经过LPS刺激后的NCI-H292细胞在阻断EGFR信号表达的变化,对比给予清肺化痰汤治含药血清干预后细胞内EGFR表达的变化,结果显示LPS诱导下细胞内的EGFR表达显上调,用EGFR阻断剂阻断EGFR信号通路后EGFR表达明显低于正常对照组,而清肺化痰汤含药血清各干预组的EGFR表达均下调。说明清肺化痰汤抑制细胞质MUC5AC的表达可能是通过抑制EGFR信号通路来实现的。结论:清肺化痰汤通过抑制MUC5AC的表达来治疗COPD的黏液高分泌,其机制可能与抑制EGFR信号通路有关。