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杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida,As)是一类重要的咸淡水养殖动物病原菌,主要引起鲑鳟鱼类如虹鳟(Oncorhynchus mykiss)、金鳟(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鲑(Salmo salar)等疖疮病及溃疡病,被感染鱼体死亡率高影响范围广,并且其宿主范围在逐年扩大,严重制约了中国鲑鳟鱼养殖业健康发展。目前,中国一般采用化学药物及各类抗生素防治杀鲑气单胞菌,抗生素药物的使用容易导致病原菌出现交叉耐药反应,同时也使人类面临环境污染及食品安全问题。疫苗是防治杀鲑气单胞菌的最有效方法,在国外,采用接种商业化疫苗方法预防此菌感染已取得较好的保护效果。因而针对虹鳟杀鲑气单胞菌开展免疫防控研究具有重要意义。本文选取蜂胶佐剂和弗氏完全佐剂分别添加到杀鲑气单胞菌灭活疫苗中,然后免疫虹鳟,评价对的虹鳟相对免疫保护率,并采集虹鳟肝、脾脏、头肾和鳃组织用于RNA的提取,分析疫苗对免疫相关基因表达的影响,以期获得具有良好免疫效果的佐剂联合疫苗。本文主要内容如下:第一部分:从本实验室保藏的2014-2015年分离自大西洋鲑和虹鳟等体内的气单胞菌50株,结合革兰氏染色、生化特性和分子特征对其进行鉴定。结果表明:50株受试菌中有7株均为G-;葡萄糖产酸产气、氧化酶阳性等;Blast比对分析发现7株菌的16S r RNA序列分别与Gen Bank数据库中杀鲑气单胞菌的不同菌株的16S r RNA基因序列同源性较高相似性达99%以上,以杀鲑气单胞菌的特异性基因fst A设计引物再次鉴定,经过比对分析后确定该7株菌均为杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.salmonicida subsp.salmonicida)。血清学分析发现7株菌均为同一血清型。7株杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(以下均称杀鲑气单胞菌As)的毒力测定结果发现,菌株NO.7毒力最强,死亡率达到100%,以该菌作为制备疫苗的菌株。第二部分:根据Gen Bank中杀鲑气单胞菌铁载受体(ferric siderophore receptor,fst A)序列设计并合成一对特异性引物,建立了检测杀鲑气单胞菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并对特异性、灵敏度和可重复性进行评价。结果显示,设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值值线性关系良好,扩增所得标准曲线为y=-4.2552x+39.644,相关系数R2为0.988,最低检测限为35拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约100倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌定量检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。第三部分:将蜂胶佐剂和弗氏完全佐剂分别与杀鲑气单胞菌灭活疫苗混合均匀,制备成蜂胶佐剂疫苗和弗氏完全佐剂疫苗,此外,将蜂胶佐剂和弗氏完全佐剂分别与PBS(p H7.3)混合均匀作为对照组。注射免疫试验共分6组,分别为A组(PBS对照组)、B组(蜂胶佐剂+灭活疫苗组)、C组(蜂胶佐剂+PBS组)、D组(灭活疫苗组)、E组(弗氏完全佐剂+灭活疫苗组)和F组(弗氏完全佐剂+PBS组)。在免疫30d后进行攻毒试验,比较各组疫苗虹鳟的相对免疫保护率,同时对免疫后不同时间段内虹鳟各主要免疫器官(肝、鳃、头肾和脾脏)中各免疫相关基因的表达量进行定量分析。结果表明:攻毒14d后A组虹鳟死亡率为100%,B组免疫保护率最高达到90%,其次是E组为85%,都明显高于D组,这说明佐剂的加入有效提高了疫苗的保护作用。免疫后各组织中的7种基因显著上调表达,且B和E组表达量普遍高于A组、D组和F组;四种组织中,IL-8、IL-1β、MHCⅠ、CD8和Ig T 5种基因的表达最大值出现在免疫后1-3d,IFN-γ和Ig M在鳃中的表达最大值出现在3-7d,各基因表达量最高值为对照组的2.0-70.0倍,攻毒7d后,各组织中7种基因表现出显著上调表达。研究结果表明制备的两种佐剂杀鲑气单胞菌灭活疫苗均有效引起了虹鳟的免疫反应参与了鱼体对疫苗的免疫应答,并且蜂胶佐剂的加入大大增强了疫苗的免疫效果。本研究丰富了免疫相关基因的分子研究,为疫苗的免疫途径及免疫效果评价提供了数据。