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研究背景
三氯生(TCS)作为一种重要的杀菌剂，广泛应用于个人护理品中，其长期暴露对斑马血管生长和神经发育具有严重的毒性作用。早期的研究发现，TCS可以使斑马鱼的发育迟缓、心包和卵黄囊肿，色素减少、脂肪代谢紊乱及部分心脏和脑部出血等异常现象，，但是，造成这些表观畸形的分子机理并不清晰。，本研究着重拟对TCS引起斑马鱼血管发育和神经毒性的作用机制展开研究。通过一系列对血管的染色可以观察到TCS急性暴露下对斑马鱼的血管产生了严重的畸形。虽然也有报道，TCS可以引起斑马鱼血管发育异常，但是很少有研究是从miRNA调控的角度出发去研究TCS引起斑马鱼血管和神经发育异常的分子机制。本研究在三氯生暴露斑马鱼胚胎（4hpf-5dpf）至幼鱼期整体miRNAs转录组深度测序的基础上，通过生物信息分析结合qRT-PCR分子验证，筛选出各组间均有差异、且高丰度表达的阳性差异miRNA3条:miR-181a-5p，miR-132-3p和miR-128-3p。据文献报道，miR-181a-5p可以引起斑马鱼脂肪代谢紊乱、血管发育异常、以及视神经病变，miR-128-3p可以调控斑马鱼神经发育异常、脂肪代谢紊乱等。因此我们选取了miR-181a-5p、miR-128-3p这两个miRNA作为研究的切入点，分别对所调控靶基因及涉及的信号通路运用分子生物学手段展开进一步探讨。本研究的展开对“污染性心脑血管疾病”的认识、预防及环境健康与生态安全具有重要的现实意义。
研究目的
本课题为了研究三氯生亚致死剂量急性暴露对斑马鱼血管发育和神经毒性的作用机制，借助新一代高通量测序技术（illuminaMiSeq）完成miRNAs的测序，对海量数据进行生物信息学分析，从中筛选出TCS处理下显著差异的miRNAs，并对其功能和涉及的代谢通路进行生物信息分析后，从中筛选出miR-181a-5p、miR-128-3p作为切入点，同时借助碱性磷酸酶、邻联苯茴香胺血管特异性染色及荧光素酶分析和原位杂交技术，检测miR-181a-5p、miR-128-3p的异常变化对血管和神经发育和形成的表观影响，及其对相关靶基因的调控功能。在确定了调控靶基因的基础上，进一步实现靶基因的功能敲降和过表达，同样分析血管发育的病理异常和对相关通路的影响，经过一系列的分析对其调控的PI3K通路的相关性进行了初步的探讨。
研究方法
1、本文以斑马鱼（Daniorerio）脊椎模式生物作为实验材料，根据前期工作对三氯生EC50（半致畸剂量）、LC50（半致死剂量）的测定结果，且参考环境中TCS的检测浓度的相关报道，对斑马鱼进行系列浓度梯度（0μg/L,62.5μg/L,125μg/L和250μg/L）暴毒处理。自胚胎持续暴露至幼鱼期（4hpf-96hpf），采用碱性磷酸酶、邻联苯茴香胺分别对斑马鱼幼鱼的肠下静脉和脑部血管进行染色，观察TCS暴露对斑马鱼血管发育的表观畸形影响。
2、收集各处理组幼鱼匀浆，提取斑马鱼幼鱼（96hpf）的总RNA，在确保各组RNA质量合格的前提下，参照IlluminaHiseq2000/2500标准进行深度测序，利用多种软件和共享数据库对测序结果进行生物信息学分析，筛选出系列显著差异（100≤FPKM≤110000；Log2|foldchange|≥1，p≤0.001）的符合要求的miRNAs进行后续的实验验证其调控功能。
3、筛选出各组间共同差异的miR-181a-5p、miR-132-3p、miR-128-3p等12条作为后续研究对象，其丰度要求限制在100≤FPKM≤110000之范围，用qRT-PCR验证其表达水平与测序结果的一致性，最后筛选其功能涉及血管和神经发育与形成相关的miR-181a-5p和miR-128-3p进行深入探讨。体外合成miR-181a-5p和miR-128-3p的mimic和inhibitor进行人为干预其过表达或敲降，同时借助碱性磷酸酶染色、邻联苯茴香胺染色和qPCR等手段验证两者的异常表达对胚胎血管和神经发育的影响与调控。
4、利用整胚原位杂交技术（WISH）、碱性磷酸酶染色和邻联苯茴香胺染色技术比较miR-181a-5p在不同浓度梯度的TCS暴露下miR-181a-5p变化模式，以及其调控相关靶基因的异常变化，同时在斑马鱼活体中实现miR-181a-5p敲降和过表达，同样检测对其调控靶基因转录和表达的影响，分析二者的变化趋势。并进一步通过双荧光素酶分析系统确证miR-181a-5p与其靶基因的调控关系。
5、通过注射miR-181a-5p的mimics和inhibitors于血管转基因斑马鱼Tg(flk1:mCherry)进行敲降和过表达，同样观察斑马鱼幼鱼血管发育情况，并检测与其血管发育相关靶基因的PI3K通路上其他基因的影响，同时通过实现其调控靶基因的过表达，统计血管的发育畸形，分析PI3K通路上相关基因的表达变化，深入探索miR-181a-5p调控的途径与机制。
6、同样，通过注射miR-128-3p的激动剂和抑制剂，初步研究其对斑马鱼血管和软骨畸形发育引起的脑部发育异常，通过血管-神经调节和骨骼-神经调节网络进而研究其对神经发育的转录后调控机制。
研究结果
1、本文主要是采用高通量测序技术，对不同浓度0μg/L，62.5μg/L，125μg/L，250μg/LTCS暴露下的斑马鱼幼鱼（96hpf）进行了microRNAs的深度测序及生物信息学分析。共获得组间有差异的miRNAs12条，最终选取了一个miR-181a-5p作为进一步研究对象。qRT-PCR验证结果显示：TCS暴露下表达上调的有7个，下调的有4个，测序结果阳性率达80%，设计的代谢通路主要是脂肪酸生物合成和磷脂酰肌醇信号系统有关，通过对阳性差异miRNAs的调控靶基因的功能分析，最终选取了一个与血管发育和神经调控相关的miR-181a-5p和miR-128-3p。miR-181a-5p可以引起斑马鱼血管发育异常，miR-128-3p可以引起斑马鱼神经发育异常。
2、显微注射miR-181a-5p激动剂和抑制剂进行过表达和敲降后，在注射后48小时的出现的畸形类型最多，例如卵黄囊肿，心胞出血等；对斑马鱼的肠下静脉和头部血管染色（静脉和节接动脉）发现，注射抑制剂组的血管出现明现的畸形。
3、通过TargetScan对miR-181a-5p进行靶基因的预测最后得到vash2和pax2a两个相关基因，双荧光素酶对miR-181a-5p与vash2和pax2a两个相关基因进行结合位点的验证，确证确实调控靶基因vash2和pax2a，通过WISH实验对靶基因表达变化进行验证，发现注射miR-181a-5p激动剂后使其表达减少，相反，注射抑制剂后表达反而上升。
4、在vash2过表达中，通过观察24小时、48小时、72小时的畸形，发现在发育到24小时时的畸形率和畸形的类型增多；同时也检测了PI3K和PI5K通路上相关基因（inpp5k、inpp5l、itpk1、pik3r3b、calm2a和itpr3)）的变化，发现过表达vash2后，其相关通路上的基因的表达下调，说明vash2通过抑制PI3K信号通路实现对血管发育的影响。
5、同样，显微注射miR-128-3p人工合成的激动剂和抑制剂进行过表达和敲降，发现在发育到48小时的畸形最严重，随着时间的延长，畸形率明显下降，通过对注射后的斑马鱼的血管染色，结果发现染色血管（静脉和间接动脉）与对照组比较，抑制剂组中出现明显的弯曲分支增加，头部血管的血流增加，与注射激动剂组结果正好相反，通过对软骨染色发现，随着TCS的暴露浓度增加，鳃骨夹角明显变小，注射miR-128-3p人工合成的抑制剂后头骨的夹角也减少，说明了miR-128-3p对斑马鱼血管和神经发育有影响。
研究结论
通过测序和生物信息学分析，筛选出两条差异表达的miRNAs(miR-181a-5p，和miR-128-3p)，它们的功能主要与脂肪酸合成、代谢和磷脂信号通路密切关联。荧光定量PCR验证结果显示miR-181a-5p和miR-128-3p表达模式与miRNA-seq测序结果一致。由ALP和O-dia染色法观察到TCS暴露后血管发育主要表现为：肠下静脉血管的扭曲，以及脉络减少和分支异常。显微注射miR-181a-5p抑制剂和激动剂可导致斑马鱼畸形类型以及畸形的百分比增加，且伴随着它的两个关键目标基因(pax2a和vash2)表达异常。PI3K是磷脂信号通路中一个重要的调节途径，而vash2作为一种血管生成因子，在PI3K通路中起着重要的作用。PI3K通路中的所有基因在vash2过表达后均有明显的表达变化，说明vash2对血管发育的影响是由P13K信号通路调节的。对miR-128-3p调控功能的研究表明：血管和软骨畸形发育，由于软骨的发育夹角异常导致脑部发育基因，进而影响神经系统的损伤。
这些结果初步解释了miR-181a-5p和miR-128-3p异常表达对血管生长和神经发育影响的作用机制与途径，揭示了二者的下游调控网络，初步评价了环境中TCS污染潜在的生态风险，揭示其致毒的分子机理。该研究将会增进对污染性心脑血管疾病的认识，同时也为污染性心脑血管疾病的分子靶标治疗提供参考。
三氯生(TCS)作为一种重要的杀菌剂，广泛应用于个人护理品中，其长期暴露对斑马血管生长和神经发育具有严重的毒性作用。早期的研究发现，TCS可以使斑马鱼的发育迟缓、心包和卵黄囊肿，色素减少、脂肪代谢紊乱及部分心脏和脑部出血等异常现象，，但是，造成这些表观畸形的分子机理并不清晰。，本研究着重拟对TCS引起斑马鱼血管发育和神经毒性的作用机制展开研究。通过一系列对血管的染色可以观察到TCS急性暴露下对斑马鱼的血管产生了严重的畸形。虽然也有报道，TCS可以引起斑马鱼血管发育异常，但是很少有研究是从miRNA调控的角度出发去研究TCS引起斑马鱼血管和神经发育异常的分子机制。本研究在三氯生暴露斑马鱼胚胎（4hpf-5dpf）至幼鱼期整体miRNAs转录组深度测序的基础上，通过生物信息分析结合qRT-PCR分子验证，筛选出各组间均有差异、且高丰度表达的阳性差异miRNA3条:miR-181a-5p，miR-132-3p和miR-128-3p。据文献报道，miR-181a-5p可以引起斑马鱼脂肪代谢紊乱、血管发育异常、以及视神经病变，miR-128-3p可以调控斑马鱼神经发育异常、脂肪代谢紊乱等。因此我们选取了miR-181a-5p、miR-128-3p这两个miRNA作为研究的切入点，分别对所调控靶基因及涉及的信号通路运用分子生物学手段展开进一步探讨。本研究的展开对“污染性心脑血管疾病”的认识、预防及环境健康与生态安全具有重要的现实意义。
研究目的
本课题为了研究三氯生亚致死剂量急性暴露对斑马鱼血管发育和神经毒性的作用机制，借助新一代高通量测序技术（illuminaMiSeq）完成miRNAs的测序，对海量数据进行生物信息学分析，从中筛选出TCS处理下显著差异的miRNAs，并对其功能和涉及的代谢通路进行生物信息分析后，从中筛选出miR-181a-5p、miR-128-3p作为切入点，同时借助碱性磷酸酶、邻联苯茴香胺血管特异性染色及荧光素酶分析和原位杂交技术，检测miR-181a-5p、miR-128-3p的异常变化对血管和神经发育和形成的表观影响，及其对相关靶基因的调控功能。在确定了调控靶基因的基础上，进一步实现靶基因的功能敲降和过表达，同样分析血管发育的病理异常和对相关通路的影响，经过一系列的分析对其调控的PI3K通路的相关性进行了初步的探讨。
研究方法
1、本文以斑马鱼（Daniorerio）脊椎模式生物作为实验材料，根据前期工作对三氯生EC50（半致畸剂量）、LC50（半致死剂量）的测定结果，且参考环境中TCS的检测浓度的相关报道，对斑马鱼进行系列浓度梯度（0μg/L,62.5μg/L,125μg/L和250μg/L）暴毒处理。自胚胎持续暴露至幼鱼期（4hpf-96hpf），采用碱性磷酸酶、邻联苯茴香胺分别对斑马鱼幼鱼的肠下静脉和脑部血管进行染色，观察TCS暴露对斑马鱼血管发育的表观畸形影响。
2、收集各处理组幼鱼匀浆，提取斑马鱼幼鱼（96hpf）的总RNA，在确保各组RNA质量合格的前提下，参照IlluminaHiseq2000/2500标准进行深度测序，利用多种软件和共享数据库对测序结果进行生物信息学分析，筛选出系列显著差异（100≤FPKM≤110000；Log2|foldchange|≥1，p≤0.001）的符合要求的miRNAs进行后续的实验验证其调控功能。
3、筛选出各组间共同差异的miR-181a-5p、miR-132-3p、miR-128-3p等12条作为后续研究对象，其丰度要求限制在100≤FPKM≤110000之范围，用qRT-PCR验证其表达水平与测序结果的一致性，最后筛选其功能涉及血管和神经发育与形成相关的miR-181a-5p和miR-128-3p进行深入探讨。体外合成miR-181a-5p和miR-128-3p的mimic和inhibitor进行人为干预其过表达或敲降，同时借助碱性磷酸酶染色、邻联苯茴香胺染色和qPCR等手段验证两者的异常表达对胚胎血管和神经发育的影响与调控。
4、利用整胚原位杂交技术（WISH）、碱性磷酸酶染色和邻联苯茴香胺染色技术比较miR-181a-5p在不同浓度梯度的TCS暴露下miR-181a-5p变化模式，以及其调控相关靶基因的异常变化，同时在斑马鱼活体中实现miR-181a-5p敲降和过表达，同样检测对其调控靶基因转录和表达的影响，分析二者的变化趋势。并进一步通过双荧光素酶分析系统确证miR-181a-5p与其靶基因的调控关系。
5、通过注射miR-181a-5p的mimics和inhibitors于血管转基因斑马鱼Tg(flk1:mCherry)进行敲降和过表达，同样观察斑马鱼幼鱼血管发育情况，并检测与其血管发育相关靶基因的PI3K通路上其他基因的影响，同时通过实现其调控靶基因的过表达，统计血管的发育畸形，分析PI3K通路上相关基因的表达变化，深入探索miR-181a-5p调控的途径与机制。
6、同样，通过注射miR-128-3p的激动剂和抑制剂，初步研究其对斑马鱼血管和软骨畸形发育引起的脑部发育异常，通过血管-神经调节和骨骼-神经调节网络进而研究其对神经发育的转录后调控机制。
研究结果
1、本文主要是采用高通量测序技术，对不同浓度0μg/L，62.5μg/L，125μg/L，250μg/LTCS暴露下的斑马鱼幼鱼（96hpf）进行了microRNAs的深度测序及生物信息学分析。共获得组间有差异的miRNAs12条，最终选取了一个miR-181a-5p作为进一步研究对象。qRT-PCR验证结果显示：TCS暴露下表达上调的有7个，下调的有4个，测序结果阳性率达80%，设计的代谢通路主要是脂肪酸生物合成和磷脂酰肌醇信号系统有关，通过对阳性差异miRNAs的调控靶基因的功能分析，最终选取了一个与血管发育和神经调控相关的miR-181a-5p和miR-128-3p。miR-181a-5p可以引起斑马鱼血管发育异常，miR-128-3p可以引起斑马鱼神经发育异常。
2、显微注射miR-181a-5p激动剂和抑制剂进行过表达和敲降后，在注射后48小时的出现的畸形类型最多，例如卵黄囊肿，心胞出血等；对斑马鱼的肠下静脉和头部血管染色（静脉和节接动脉）发现，注射抑制剂组的血管出现明现的畸形。
3、通过TargetScan对miR-181a-5p进行靶基因的预测最后得到vash2和pax2a两个相关基因，双荧光素酶对miR-181a-5p与vash2和pax2a两个相关基因进行结合位点的验证，确证确实调控靶基因vash2和pax2a，通过WISH实验对靶基因表达变化进行验证，发现注射miR-181a-5p激动剂后使其表达减少，相反，注射抑制剂后表达反而上升。
4、在vash2过表达中，通过观察24小时、48小时、72小时的畸形，发现在发育到24小时时的畸形率和畸形的类型增多；同时也检测了PI3K和PI5K通路上相关基因（inpp5k、inpp5l、itpk1、pik3r3b、calm2a和itpr3)）的变化，发现过表达vash2后，其相关通路上的基因的表达下调，说明vash2通过抑制PI3K信号通路实现对血管发育的影响。
5、同样，显微注射miR-128-3p人工合成的激动剂和抑制剂进行过表达和敲降，发现在发育到48小时的畸形最严重，随着时间的延长，畸形率明显下降，通过对注射后的斑马鱼的血管染色，结果发现染色血管（静脉和间接动脉）与对照组比较，抑制剂组中出现明显的弯曲分支增加，头部血管的血流增加，与注射激动剂组结果正好相反，通过对软骨染色发现，随着TCS的暴露浓度增加，鳃骨夹角明显变小，注射miR-128-3p人工合成的抑制剂后头骨的夹角也减少，说明了miR-128-3p对斑马鱼血管和神经发育有影响。
研究结论
通过测序和生物信息学分析，筛选出两条差异表达的miRNAs(miR-181a-5p，和miR-128-3p)，它们的功能主要与脂肪酸合成、代谢和磷脂信号通路密切关联。荧光定量PCR验证结果显示miR-181a-5p和miR-128-3p表达模式与miRNA-seq测序结果一致。由ALP和O-dia染色法观察到TCS暴露后血管发育主要表现为：肠下静脉血管的扭曲，以及脉络减少和分支异常。显微注射miR-181a-5p抑制剂和激动剂可导致斑马鱼畸形类型以及畸形的百分比增加，且伴随着它的两个关键目标基因(pax2a和vash2)表达异常。PI3K是磷脂信号通路中一个重要的调节途径，而vash2作为一种血管生成因子，在PI3K通路中起着重要的作用。PI3K通路中的所有基因在vash2过表达后均有明显的表达变化，说明vash2对血管发育的影响是由P13K信号通路调节的。对miR-128-3p调控功能的研究表明：血管和软骨畸形发育，由于软骨的发育夹角异常导致脑部发育基因，进而影响神经系统的损伤。
这些结果初步解释了miR-181a-5p和miR-128-3p异常表达对血管生长和神经发育影响的作用机制与途径，揭示了二者的下游调控网络，初步评价了环境中TCS污染潜在的生态风险，揭示其致毒的分子机理。该研究将会增进对污染性心脑血管疾病的认识，同时也为污染性心脑血管疾病的分子靶标治疗提供参考。