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柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)严重威胁世界柑橘产业的发展,对其造成巨大经济损失。HLB具有一定的潜伏期,从病原菌感染到引起黄化症状需要一定的时间,因此建立一种高效、灵敏、快速的检测方法,应用于柑橘产业的健康发展非常必要。细菌分泌蛋白是细菌产生的一种效应因子,在细菌的致病过程中起重要作用。本研究从柑橘黄龙病菌亚洲株系基因组中分析了病原菌分泌蛋白系统及相关分泌蛋白的10个基因,通过荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)方法,筛选获得RNA含量较高的2个蛋白基因。开展了分泌蛋白基因表达量和亚细胞定位研究,为研究该蛋白参与的HLB致病机理奠定基础;同时对这2个分泌蛋白基因进行原核表达,免疫小鼠制备了特异抗血清,为408和PAP蛋白功能研究和开发HLB的蛋白检测产品提供基础。具体结果如下:(1)以海南琼中、琼海感染HLB的绿橙为材料,提取总DNA和RNA,制备DNA和cDNA。根据柑橘黄龙病菌亚洲株系基因组中分析的病原菌分泌蛋白系统及相关分泌蛋白的6个基因,设计荧光定量PCR(RT-qPCR)引物,对HLB样品的6个基因mRNA表达量进行定量检测。结果表明:琼海和琼中样品中的408和PAP基因mRNA表达量较高,Ct值在15～35之间。(2)以提取的DNA为模板,扩增出408和PAP全长基因,序列分析表明,与报道的柑橘黄龙病菌亚洲种psy62株系(GenBank no.CP001677.5)408和PAP基因序列相似性在99%以上,而氨基酸序列与该株系的408和PAP蛋白一致。进一步预测分析表明,408蛋白含有1个可信度较高的N端结构域,该结构域的功能可能与菌毛形成蛋白有关(Pilus formation protein N terminal domain),C端含有两个高度保守的基序(Motif 1和Motif 2);PAP蛋白含有2个高度可信的与分泌功能相关的结构域,即CPaC结构域(AA22-474)和Secretin结构域(AA262-419)。(3)根据筛选获得RNA含量均较高的408和PAP两个蛋白基因,设计特异引物,分别构建到GFP荧光表达载体GV1300,将测序正确的质粒命名为GV1300-408和GV1300-PAP。将重组质粒及对照质粒转化GV1301农杆菌,分别注射本氏烟草(Nicotiana benthamiana),进行亚细胞定位研究。实验结果表明:408蛋白定位于烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质,而PAP蛋白也定位于烟草叶肉细胞的细胞核和细胞质。(4)将408和PAP分泌蛋白基因的全长ORFs进行克隆,构建到原核表达质粒pET32a(+)中,转化大肠杆菌BL21表达菌,经终浓度为1 mmol/LIPTG诱导后,融合蛋白进行了高效的表达。可溶性分析表明408和PAP蛋白在上清液中含量较少,沉淀含量较多,表明408和PAP蛋白主要以包涵体的形式进行表达。将融合蛋白经Ni2+-NTA层析柱纯化后,408蛋白主要存于150 mmol/L咪唑的洗脱液中,而PAP蛋白在100 mmol/L和150 mmol/L咪唑的洗脱液中含量较多。(5)将纯化后的408和PAP融合蛋白多次免疫小鼠后获得抗血清。效价检测结果表明,408多抗血清效价在1:500～1:5000之间,PAP多抗血清效价在1:500～1:1000之间。Western blot特异性检测结果无明显杂带。使用采取的绿橙样品提取蛋白进行检测,结果明显呈阳性。