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霍乱弧菌（Vibrio cholerae）是弯曲的革兰氏阴性细菌,能引起急性腹泻疾病霍乱（Cholera）。当霍乱弧菌进入动物或人体后,需要克服胃酸屏障,通过覆盖上皮的粘液层,在其表面定殖并产生毒素,随后通过宿主的排泄,肠道中的霍乱弧菌再次回到体外环境中,从而完成其感染周期。因此霍乱弧菌在小肠内有效地定殖是其对宿主产生致病作用的必要条件。研究霍乱弧菌肠道定殖机制的动物模型主要有小鼠和兔子模型,小鼠又分为乳鼠和成鼠两类。其中毒力基因的表达是霍乱弧菌在乳鼠肠道定殖所必需的,但霍乱弧菌在成鼠肠道定殖的分子机制尚不清楚。前期实验结果发现,毒素调控蛋白TcpP胞内结构域半胱氨酸残基突变后,突变株在成鼠肠道的定殖能力显著减弱。有研究表明活性氧分子（Reactive oxygen species,ROS）对霍乱弧菌在成鼠肠道中的定殖具有重要影响,且TcpP的调控功能在ROS条件下被抑制,而TcpP半胱氨酸突变体对ROS的抑制作用不敏感,尽管在含有ROS的条件下,其仍然能大量激活下游毒力基因的表达。由此推测霍乱弧菌通过感知成鼠肠道中的ROS从而调控TcpP的功能,进而抑制毒力基因的表达,使其在成鼠肠道中更好定殖。因此,为了阐明霍乱弧菌在成鼠肠道中定殖的分子机制,本论文开展了以下几部分的研究。首先本实验研究了毒素调控蛋白TcpP对于霍乱弧菌在成鼠肠道中的定殖作用。已知TcpP具有DNA激活功能的N端胞质结构域,其胞内半胱氨酸残基会影响二硫键的形成。通过AMS自由巯基捕获实验证明了TcpP胞内半胱氨酸残基可感知胞外ROS的存在。在利用荧光定量PCR检测TcpP下游目的基因转录效率时发现,在ROS条件下,TcpP激活下游基因表达的能力极大下降。而当TcpP胞内结构域的半胱氨酸残基突变后,其仍然能正常激活毒力基因的表达,这说明毒素调控蛋白TcpP可利用胞内结构域的半胱氨酸残基感知胞外ROS从而改变其激活下游毒力基因表达的功能。研究TcpP半胱氨酸突变株的定殖能力发现,在链霉素处理的成鼠肠道定殖模型中,TcpP半胱氨酸突变株的定殖能力与野生型相比显著减弱,而在成鼠肠道中灌入能消除ROS的N-乙酰半胱氨酸后,突变株与野生型的定殖能力几乎无异。且tcp P基因缺失后,缺失株在成鼠肠道中的定殖能力显著增强,这说明霍乱弧菌可通过TcpP感知肠道中的ROS从而抑制下游毒力基因的表达,而这一抑制作用对霍乱弧菌在成鼠肠道中的定殖十分关键。已知TcpP调控的下游基因包括omp T,vca0536,toxT,为确定TcpP通过抑制哪个下游基因的表达而促进定殖,本实验分别构建了omp T,vca0536,toxT基因缺失突变株。通过分析突变株的定殖能力发现,当toxT缺失后,霍乱弧菌在成年鼠肠道中的定殖能力显著增强。这些结果都表明,抑制毒力基因的表达能促进霍乱弧菌在成鼠肠道中定殖。ToxT是霍乱弧菌关键的毒力基因表达调控蛋白。为研究ToxT对霍乱弧菌在成鼠肠道中定殖的作用,本实验分别构建了toxT、下游基因簇（vc（0819-0825）,vc（0828-0837）,vc（0840-0845））的缺失株、以及toxT组成型表达菌株,通过分析这些突变株在成鼠肠道中的定殖能力发现,这些下游基因簇缺失株在成鼠肠道中的定殖能力与野生型相比均显著增强,但toxT组成型表达菌株的定殖能力显著减弱。这充分说明毒力基因的表达不利于霍乱弧菌在成年鼠肠道中的定殖。为证明ToxT是否通过调控下游毒力基因的表达而影响霍乱弧菌在成鼠肠道中的定殖,本实验在组成型表达toxT突变株的基础上分别敲除了已知受ToxT调控的毒基力基因簇,结果发现该菌株在成鼠肠道中的定殖能力与toxT组成型表达菌株一样,相较野生型显著减弱。这说明除了受ToxT调控的毒力基因以外,还有一些受ToxT调控的未知因子对霍乱弧菌在成年鼠肠道中的定殖具有重要的影响。在霍乱弧菌中,toxT的转录受到转录调控因子TcpP和Tox R共同调控,研究Tox R对霍乱弧菌在成鼠肠道中的定殖作用时,发现tox R缺失后,霍乱弧菌的定殖能力显著减弱,这与TcpP的作用相反。这说明Tox R对霍乱弧菌在成年鼠肠道中的定殖至关重要。已知Tox R调节子可调控毒力基因,外膜孔蛋白Omp U和Omp T及其他下游基因等,研究发现omp T缺失株在成鼠中的定殖能力与野生型无明显差异,而omp U缺失株在成鼠肠道中几乎不能定殖,这说明Tox R可能通过激活外膜孔蛋白Omp U来增强霍乱弧菌在成鼠肠道中的定殖。综上所述本研究发现霍乱弧菌通过毒素调控蛋白TcpP胞内半胱氨酸残基感知胞外ROS的存在,抑制下游toxT基因的表达从而协助霍乱弧菌在成鼠肠道中的定殖。而ToxT通过抑制毒力基因及其他一些未知因子的表达,增强霍乱弧菌在成年鼠肠道中的定殖,另外,调控蛋白Tox R通过激活外膜孔蛋白Omp U的表达来增强霍乱弧菌在成鼠肠道中的竞争定殖能力。基于这些实验结果,我提出了霍乱弧菌在成鼠肠道中的生存竞争定殖模型。本研究为探究霍乱弧菌在成年鼠肠道定殖的分子机制提供理论依据,为进一步防治霍乱弧菌感染提供预防治疗思路具有重大意义。