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柑橘溃疡病(Citrus Bacterial Canker Disease,CBCD)是危害世界柑橘产业的重要病害之一,为国内外检疫的重要对象。在我国柑橘产区都有发生,南方各省尤为严重,它是由黄单胞杆菌柑橘致病变种(Xanthomonas citri subsp.citri,Xcc)引起,病菌主要侵染芸香科植物,以甜橙、脐橙、酸橙、柠檬等品种,危害柑橘叶片、枝梢、果实,以苗木、幼树受害最重,造成落叶、枯梢、树势衰弱、落果等,严重影响产量和品质。可危害芸香科数十种植物,传播途径广、传染迅速、危害严重,顽固难防。当前田间主要使用铜基杀菌剂和抗生素制剂,但防效不佳,而对于已患病的植株则采取连根拔除,集中焚毁的手段进行根除。目前我国正在进行柑橘非疫区建设,因此开展柑橘溃疡病菌的快速、灵敏和准确的检测技术研究具有重要意义。单链抗体(single chain antibody,scFv)是抗体分子中保留抗原结合部位的最小功能片段,分子量约为完整抗体分子的1/6,其优越性在于可通过包涵体大量表达、易于基因工程操作,尤其易于构建抗体融合蛋白,基于这些特点,重组抗体在医疗领域的应用前景已引起广泛的关注。重庆大学基因工程研究中心利用柑橘溃疡病菌制备了柑橘溃疡病菌的单链重组抗体及二硫键稳定性抗体,但是scFv的稳定性欠佳,并且容易发生聚集,在制备过程中难以得到较高浓度的活性蛋白。二硫键稳定Fv抗体(disulfide stabilized Fv fragments,dsFv)比单链抗体更加稳定,但是该种抗体也具有产量很低且复性效率不高的缺陷。为此,采用在二硫键稳定抗体dsFv的基础上再引入一条连接肽序列以连接VH和VL基因的方法,将这两种抗体的优点集合研发一种新型抗体,即获得了稳定性更佳的单链-二硫键稳定抗体(single chain disulfide-bond Fv, sc-dsFv)抗体。本研究的目的在于针对柑橘溃疡病scFv抗体稳定性较差及dsFv抗体具有的产量很低且复性效率不高的缺陷,构建一种稳定性和复性效率都较高的新型抗体,以克服前二者的缺陷,并为今后柑橘溃疡病菌Xcc的免疫诊断和防治研究提供新的工具和途径。研究的主要内容包括:在实验室已经获得二硫键稳定抗体的基础上本研究以鼠源抗柑橘溃疡病菌表面脂多糖的二硫键稳定性抗体dsFv为模板,利用重叠延伸PCR在重链可变区VH和轻链可变区VL之间引入一条人类抗体重链恒定区1(CH1)的5’端12个氨基酸的序列作为连接肽,构建重组单链二硫键稳定抗体基因,将其连接入pET24a(+)原核表达载体并转化入表达菌株E.coli BL21(DE3),经表达、复性并纯化后得到高纯度的sc-dsFv抗体,并对其特异性、亲和力和稳定性进行测定研究。本研究已获得主要研究结果如下:①分别以dsFv-VL基因和dsFv-VH基因为模板通过一轮PCR扩增,在重链可变区VH和轻链可变区VL之间分别引入一条人类抗体重链恒定区1(CH1)的5’端12个氨基酸的序列作为连接肽,再经过一轮重叠延伸PCR将轻链基因与重链基因融合构建sc-dsFv重组抗体基因,经测序结果表明基因序列正确,连接肽序列被成功引入两段基因之间。②构建好的基因序列经酶切后连接表达载体pET24a(+),并转化入原核表达菌种BL21(DE3)中。通过IPTG诱导,获得包涵体表达蛋白。对所表达蛋白进行SDS-PAGE电泳及Western blot杂交,电泳结果显示目标蛋白分子量为30kDa,Western blot杂交结果显示目标蛋白表达正确与预期构想一致,即重组抗体sc-dsFv成功在原核表达载体中以包涵体形式超表达,经计算每百毫升菌液产包涵体约0.2g。③诱导表达获得的sc-dsFv包涵体经盐酸胍溶解后稀释于复性缓冲液中复性,利用Ni-NTA柱对复性后的Xcc-sc-dsFv进行纯化,灰度分析表明其纯度约为90%。④用大分子相互作用仪(biacore)分析Xcc-sc-dsFv抗体的亲和力,结果表明Xcc-sc-dsFv对其抗原Xcc的脂多糖LPS具有较高的亲和力,结合常数(ka)为5.31×106 M-1·s-1,解离常数(kd)为5.53×10-2 s-1,亲和常数(KD)为1.04×10-8M;Dot-blot和ELISA的特异性检测,显示出sc-dsFv抗体对目的抗原菌Xcc特异性结合活性良好,对其它十种近源菌无结合活性。⑤以抗柑橘溃疡病scFv抗体和dsFv抗体为对照,检测所获得的sc-dsFv的贮存稳定性。结果显示,在各种温度处理中,三种抗体中,scFv的贮存稳定性最低,dsFv的贮存稳定性次之,sc-dsFv的稳定性最高。在37℃条件下,scFv在12 h内,活性急剧下降到最初活性的23.7%,dsFv在12 h后活性部分下降并在72 h后保持最初活性的63.2%,而sc-dsFv的活性一直略高于dsFv直到48小时后基本与其一致。scFv在35℃孵育3 h活性迅速下降至最初的17.2%,已经基本失活,45℃孵育3 h后dsFv仍具有58.6%的活性,在55℃孵育3 h后基本无活性,sc-dsFv在45℃-55℃之间的活性略高于dsFv。在-20℃冻存试验中scFv的活性在一周之内下降至20%左右,在60天之内活性完全消失。dsFv和sc-dsFv的活性随着时间的推移都有所下降,在第150天后前者的活性降低至50%左右,而sc-dsFv活性保持在70%左右。说明sc-dsFv抗体的稳定性与dsFv相比有了一定的提高。