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一烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜体外模型建立目的收集临床分离的烟曲霉菌株,与野生型铜绿假单胞菌混合制备成体外混合生物被膜,模型制备成功。为后续实验研究做准备。方法收集临床分离的烟曲霉菌株,并由广西医科大学第一附属医院临床微生物检验中心鉴定。以RPMI-1640作为培养基,无菌玻璃细胞爬片作为载体。于混合生物被膜建立前16-18小时调制烟曲霉孢子悬液置于24孔板中,之后用磷酸盐缓冲液冲洗孔板洗掉浮游菌,将野生型铜绿假单胞菌増菌过夜后调制1×10~6ml-1等体积加入各孔。建立体外混合生物被膜。于建模24小时后取出载体,混合生物膜用扫描电镜观察表面结构。结果烟曲霉临床菌株可以与野生型铜绿假单胞菌形成体外混合生物被膜。结论烟曲霉菌株在适当条件下可以与野生型铜绿假单胞菌形成混合生物被膜,通过扫描电镜观察:野生型铜绿假单胞菌黏附于烟曲霉菌丝上,可以在体外成功构建两者混合生物被膜且用于后续研究。二铜绿密度感应系统对烟曲霉-铜绿混合生物膜的体外作用研究目的通过野生型铜绿假单胞菌及两种密度感应缺陷菌株分别与烟曲霉菌株形成的混合生物被膜的比较,探讨铜绿密度感应系统对混合生物被膜的体外作用。方法收集临床分离的烟曲霉菌株,以RPMI-1640作为培养基,无菌玻璃细胞爬片作为载体。于混合生物被膜建立前16-18小时调制烟曲霉孢子悬液浓度为1×106 ml-1置于24孔板中,其中一组作为对照组(不加铜绿),之后用磷酸盐缓冲液冲洗孔板洗掉浮游菌,将野生型铜绿假单胞菌(PAO1)、及两种密度缺陷菌株P.aΔLas I/Rhl I、P.aΔLas R/Rhl R増菌过夜后均调制浓度为1×106 ml-1等体积加入各孔。建立体外烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜模型。于建模24小时后取出载体,通过结晶紫半定量原位染色法测四组载体上生物总量;激光共聚焦及扫描电镜观察四组混合生物被膜表面形态。结果两种密度感应缺陷菌株与烟曲霉菌形成的混合生物被膜的总量及镜下所见混合后菌丝密度均明显高于野生型铜绿假单胞菌与烟曲霉形成的混合生物被膜量。结论铜绿假单胞菌相关的QS密度感应系统能够影响铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜的形成总量及菌丝的生长,且在其中起到了一定的抑制作用。三异绿原酸对烟曲霉-铜绿混合生物被膜的体外破坏作用目的探讨异绿原酸及其联合两性霉素B、美罗培南对烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜的体外破坏作用,为进一步研究针对能破坏铜绿假单胞菌、烟曲霉菌混合感染患者的药物治疗奠定基础。方法96孔板微量液基稀释法分别测定异绿原酸、美罗培南、两性霉素B对野生型铜绿假单胞菌浮游菌、烟曲霉孢子悬液的最低抑菌浓度、最低杀菌浓度、最低杀真菌浓度;微量棋盘格法测两性霉素B联合美罗培南对烟曲霉-野生型铜绿假单胞菌混合生物被膜的最有效抑菌浓度时两两联合的药物组合剂量;24孔板测定不同剂量的异绿原酸联合两性霉素B、美罗培南对混合生物被膜的抑制率。试验分为空白组(仅含有培养液)、阴性对照组(混合生物被膜不加药物)、异绿原酸组(250μg/m L、500μg/m L、1000μg/m L)、异绿原酸(250μg/m L、500μg/m L、1000μg/m L)联合两性霉素B、美罗培南组、两性霉素B联合美罗培南组。结晶紫半定量法检测载体上生物总量;XTT减低法测定各组混合生物被膜的代谢活性;激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察各组混合生物被膜表面形态。结果各实验组药物作用于混合生物被膜24小时后结晶紫半定量检测结果显示:1000μg/m L异绿原酸联合两性霉素B+美罗培南组的OD590比单用1000μg/m L异绿原酸组及两性霉素B+美罗培南组低,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。XTT减低法结果显示:1000μg/m L异绿原酸联合两性霉素B+美罗培南组分别与对阴性照组组、两性霉素B联合美罗培南组、1000μg/m L异绿原酸组相比,明显减低了混合生物被膜的代谢活性。激光共聚焦显微镜观察:1000μg/m L异绿原酸作用时,混合BF无论胞外基质还是菌丝密度、活力均较阴性对照组有轻度减少;1000μg/m L异绿原酸联合两性霉素B+美罗培南组较阴性对照组比较混合生物被膜菌丝密度及活力以及胞外多糖较阴性对照组明显减少,可见较多死亡菌丝,菌丝密度变得稀疏,菌丝数量减少。扫描电镜观察:1000μg/m L异绿原酸单用时混合生物被膜的胞外基质、菌丝密度较阴性对照组略减少;1000μg/m L异绿原酸联合两性霉素B+美罗培南组较阴性对照组混合生物被膜的菌丝密度、附着的铜绿假单胞菌密度及胞外基质均明显减少,残存的菌丝变瘪。结论异绿原酸对于体外构建的野生型铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜具有减少其胞外基质产生的作用。联合应用异绿原酸与两性霉素B+美罗培南,对混合生物被膜内烟曲霉生长出的菌体和所形成的菌丝的杀真菌作用及对混合生物被膜中铜绿假单胞菌的杀细菌作用都会明显增强。异绿原酸与两性霉素B及美罗培南对烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜的抑制具有协同作用。