[研究背景]"肺纤维化"是"弥漫性间质性肺疾病(间质性肺疾病)的简称,是一组慢性进行性破坏性肺间质疾病。病理特征:肺泡壁呈慢性炎症和与肺间质纤维化改变。其中临床最常见为特发性肺纤维化患者,占所有肺纤维化的65%。影像学表现:胸膜下肺组织呈网状结构,或出现蜂窝状改变,双下肺表现明显,可出现磨玻璃影改变[1]。关于肺纤维化的发病机制,目前尚未完全阐明。既往有研究表明肺损伤后在肺泡上皮修复的过程中,出现了肺间质细胞的迁移、增殖及活化,导致成纤维细胞灶的形成,引起细胞外基质大量分泌并蓄积引起肺间质增宽,以上过程为不可逆性破坏[2]。肺纤维化作为呼吸系统四大病种之一,病因多种多样,比如物理因素、感染性因素、血管性因素等。在临床工作中,随着农药百草枯的广泛使用,百草枯中毒在临床急症中频发,百草枯中毒导致肺纤维化患者逐渐增加。百草枯(PQ),目前应用最广的有机杂环类除草剂,商品名为克无踪,化学成分为1,1’-二甲基-4,4’-联吡啶二氯化物。临床中口服百草枯后经胃肠道吸收率为5-15%,百草枯吸收后可分布于全身组织器官,由于肺泡上皮细胞的主动摄取功能,故肺组织中浓度最高,肺组织浓度可达到血液组织浓度的10-90倍,中毒患者1周内主要表现以急性肺水肿为主,1周后可出现肺纤维化改变,并且逐渐加重,2-3周达到高峰,形成明显纤维化。肺脏作为百草枯中毒的主要靶器官,是目前百草枯中毒死亡的主要原因。大量中毒患者多死于早期肺损伤所导致的急性呼吸窘迫综合症(ARDS),晚期死亡原因多为百草枯中毒引起的肺纤维化[3]。急性百草枯中毒(acute paraquat poisoning,APP)导致肺纤维化既往相关研究发现:急性百草枯中毒后百草枯于肺泡上皮细胞大量蓄积,引起肺泡上皮细胞损伤与间质细胞增生,成为目前急性百草枯中毒肺纤维化研究热点。以上发生过程中出现成上皮细胞数量降低,形态改变,纤维细胞的数量明显增加,从而引起肺组织纤维化发生[1]。细胞因子(CK)网络失衡学说在急性百草枯中毒发病机制中起重要作用,在众多细胞因子中,TGF-β1公认为始动因子。研究发现,以百草枯刺激A549细胞,可观察到百草枯上皮细胞与间质细胞形态变化,以及TGF-β1含量明显增高,证实TGF-β1可能是百草枯诱导肺纤维化过程中的关键因子[5]。在肺纤维化发生发展过程中,上皮细胞标志性蛋白与间质细胞标志性蛋白表达的含量变化[6-9],可作为证实上皮间质转化(EMT)的重要依据。本研究的第一部分:跟踪急性百草枯中毒患者双肺CT变化,筛选肺纤维化患者为研究对象,按时间点留取血液标本,检测百草枯中毒患者血清中炎性因子TGF-β1的含量变化,分析肺纤维化与炎性因子变化的相关性。第二部分:选择A549细胞作为研究对象,通过TGF-β1、百草枯分别刺激A549细胞制造EMT的细胞模型,讨论TGF-β1与百草枯导致肺纤维化机制。第三部分:选择小鼠为研究对象,通过给予小鼠鼻饲百草枯建立肺纤维化动物模型,从组织学及蛋白表达分子水平检测TGF-β1在肺纤维化发病中的表达变化来预测可能的肺纤维化机制。目前为止,急性百草枯中毒仍无有效的治疗方法,临床死亡率居高不下,造成极大的经济损失。因此,探索急性百草枯中毒机制,明确治疗靶点,将为百草枯中毒临床治疗指引方向。[实验方法与研究内容]第一部分:急性百草枯中毒患者血液中炎症指标变化。选取2015.01-2016.01因急性百草枯中毒就诊于滨州医学院附属医院患者,服药24小时内,年龄18岁-60岁,每7天复查双肺CT 了解肺部影像学进展情况,检测3小时、51小时、147小时内血浆中E-cadhern、a-SMA、TGF-β,浓度变化。第二部分:细胞实验研究百草枯与TGF-β1导致肺纤维化的作用及分子机制。共设置四个实验组:空白对照组、百草枯处理组、TGF-β1诱导组、百草枯+TGF-β1阻断组。外源性TGF-β,组、百草枯溶液组、百草枯+TGF-β1阻断剂组,分别刺激A549细胞,观察A549细胞形态变化,免疫荧光与Western Blotting检测显示细胞表面上皮标志性蛋E-Cadherin与间质标志性蛋白a-SMA表达情况。第三部分:动物实验研究TGF-α 1在百草枯中毒导致小鼠肺纤维化发病中的作用及机制。60只雄性小鼠随机分为实验动物组(P组)、生理盐水对照组(N组)。P组实验动物均给予百草枯80mg/kg,用生理盐水稀释至lml后一次性灌胃染毒。N组采用生理盐水80mg/kg灌胃,实验日期以动物灌胃造模试验当天为实验0天,实验第1天、3天、7天、14天、21天分别处死6只动物,血浆行ELISA检查检测E-cadhern、a-SMA、TGF-β1水平,HE染色观察肺组织形态变化,电镜观察上皮细胞形态变化及胶原沉积现象,选取TGF-β1、上皮细胞标志性蛋白(E-cadherin)、间质细胞标志性蛋白(a-SMA)作为检测对象行免疫组化检查。结果显示:随着中毒时间的延长,与N组比较,P组TGF-β,表达增高,证实TGF-β 1在肺纤维化早期起促进肺纤维化发展的作用。组织学检查证实急性百草枯中毒后肺泡上皮细胞形态改变,表达下降,间质细胞表达上升,胶原蛋白沉积,证实肺纤维化模型成功。[实验结果]1.急性百草枯中毒患者肺部影像学改变与血浆中TGF-β1、E-cadhern、a-SMA含量。研究表明急性百草枯中毒致肺纤维化患者与对照组比较,中毒3小时TGF-β1含量无明显变化,51小时、147小时血浆中TGF-β1含量明显增加,有统计学意义。在中毒早期TGF-β 1含量逐渐增高与双肺CT肺纤维化进程一致,说明TGF-β 1可能参与并促进肺纤维化的进程。急性百草枯中毒患者血浆中E-Cadherin含量于3小时、51小时与对照组比较无明显降低,第147小时比较明显降低,说明随着时间延长,上皮细胞标志蛋白表达降低。与此相反,a-平滑肌肌动蛋白含量于第3小时比较无明显变化,51小时、147小时比较明显增高,说明随着时间延长,间质细胞标志性蛋白逐渐增多。2.细胞实验研究百草枯与TGF-β 1导致肺纤维化的作用及分子机制。研究表明在A549细胞培养液中分别加入TGF-β,,百草枯,百草枯+TGF-β1阻断剂。TGF-β,组可见A549细胞形态变化,由立方形或三角形转变成长梭形,细胞呈索条状松散分布,即细胞发生了 EMT现象;百草枯组细胞同样发生了 EMT现象,但细胞形态变化不如TGF-β1诱导组显著。百草枯+TGF-β1阻断组细胞形态改变较百草枯组减轻。免疫荧光与Western Blotting检测:TGF-β1、百草枯组E-Cadherin表达减少,a-SMA表达增加,百草枯+TGF-β 1阻断组变化较前两组减轻。以上结果说明TGF-β,作为肺纤维化的始动因子可启动肺纤维化进程,百草枯可能通过诱导A549细胞产生TGF-β1从而发生肺纤维化,TGF-β 1阻断组可抑制百草枯导致肺纤维化的发展。3.动物实验研究TGF-β1在百草中毒导致诱导小鼠肺纤维化发病中的作用及机制。(1)研究表明急性百草枯中毒小鼠血浆中TGF-β1含量于第1、3、7、14天明显增高,21天比较无意义。急性百草枯小鼠患者血浆中E-Cadherin含量于第14、21天时与对照组比较明显降低,说明随着时间延长,上皮细胞表达降低。a-平滑肌肌动蛋白含量于第7、14、21天比较明显增高,说明随着时间延长,间质细胞逐渐增多。(2)HE染色表现急性百草枯中毒小鼠肺泡间隔破坏,增宽,肺泡内见渗出物与血细胞。(3)电镜观察急性百草枯中毒小鼠肺泡上皮细胞破坏明显,肺间质明显增宽,胶原表达增加。(4)急性百草枯中毒小鼠肺组织中羟脯胺酸含量较对照组明显增高。(5)免疫组化显示随着中毒时间延长急性百草枯中毒小鼠肺组织中TGF-β,表达增高,E-Cadherin表达下降,a-SMA表达增高。[结论]通过急性百草枯中毒患者双肺CT变化及给予小鼠百草枯灌胃造模证实急性百草枯中毒肺纤维化模型成立。急性百草枯中毒后可引起血浆及肺组织中E-Cadherin表达下降,a-SMA表达增多,肺组织中羟脯胺酸含量增加进一步证实肺纤维化诊断。TGF-β1作为促炎因子,在肺纤维化的发病过程中起到始动因子的作用。急性百草枯中毒后血浆及肺组织中TGF-β1表达增加,与肺纤维化进展相关;通过细胞实验证实百草枯通过刺激A549细胞产生TGF-β 1可引起细胞EMT发生,TGF-β1阻断组可抑制EMT的进展。综合以上结论证实百草枯通过诱导机体产生TGF-β 1从而发生肺纤维化。