口腔黏膜由复层鳞状上皮细胞覆盖,该层细胞形成了抵御病原微生物入侵的重要防线。受黏膜上皮细胞迁移及增殖活性影响,黏膜上皮的再上皮化进程很大程度上决定了黏膜伤口的愈合速度。以往研究显示,糖尿病导致的高糖环境严重降低了皮肤上皮角化细胞的迁移和增殖能力,进而减缓了皮肤伤口的愈合速度。而作为叉头转录因子亚家族成员的FOXO1转录因子被证实能够参与细胞凋亡、抗氧化应激和糖代谢的调节,相比于血糖正常动物的皮肤伤口区域,糖尿病动物皮肤伤口区域FOXO1活性显著提高。然而,目前有关糖尿病影响口腔黏膜伤口愈合的相关研究极少。本文分析了血糖正常及糖尿病情况下的口腔黏膜伤口愈合过程,并研究了FOXO1对口腔黏膜伤口愈合的影响,此外,还考察了口腔内牙周病致病菌作为潜在的局部影响因素,对口腔黏膜伤口愈合的影响。(1) FOXO1影响口腔黏膜伤口愈合细胞机制：本文首先利用Cre/loxP系统敲除了小鼠上皮细胞中的FOXO1基因,并通过链尿霉素腹腔注射以使小鼠形成Ⅰ型糖尿病。随后,通过穿孔器使小鼠舌背表面形成1.5mm直径的黏膜伤口,以比较不同小鼠的伤口愈合情况。研究结果显示,与血糖正常动物相比,糖尿病动物受高糖环境的影响,其黏膜上皮细胞的迁移和增殖活性分别下降了83%和54%,导致糖尿病动物黏膜伤口愈合速度显著降低,体外实验也证实了高糖环境对细胞迁移和增殖活性的抑制作用。为分析细胞迁移和增殖活性的改变机制,本文考察了上皮细胞中特异性敲除FOXO1基因的小鼠,在血糖正常与糖尿病情况下的愈合情况。研究发现,受糖尿病的影响,FOXO1在伤口区黏膜上皮细胞中的活化水平较血糖正常动物高2.6倍,而FOXO1基因敲除后,受糖尿病影响而降低的细胞迁移和增殖活性均显著恢复,但是,在血糖正常动物中,基因敲除通过降低细胞迁移活性进而减缓了伤口愈合。(2) FOXO1下游靶基因的筛选及鉴定：为考察FOXO1影响口腔黏膜伤口愈合的分子机制,通过基因芯片及Real-time PCR技术,筛选出受FOXO1调控及高糖环境影响的下游基因CCL20和IL1F9。结果显示,受高糖环境的刺激,体外培养的人口腔黏膜上皮细胞中CCL20和ILlF9的mnRNA分别提高了64%和33%,而受FOXO1基因敲除的影响,CCL20和IL1F9的mRNA水平显著降低。与体外实验结果一致,在糖尿病动物的口腔黏膜伤口新生上皮中,CCL20和IL1F9蛋白表达水平较血糖正常动物显著提高,而在FOXO1基因敲除后,二者蛋白表达水平显著降低。(3)CCL20与IL1F9对口腔黏膜上皮细胞迁移的影响：本文利用中和抗体,降低了高糖环境中口腔黏膜上皮细胞产生的过量CCL20及ILlF9,以考察其对细胞迁移活性的直接影响。过量的CCL20或IL1F9被中和后,细胞在高糖环境中的迁移水平分别提高60%及110%。当CCL20与IL1F9被同时中和后,细胞迁移活性的提升表现出叠加的效果。同时,在标准低糖浓度环境中,添加重组的CCL20或IL1F9导致细胞的迁移活性降低。上述研究结果均表明,过量的CCL20与IL1F9抑制了细胞迁移,进而解释了高糖环境通过刺激FOXO1舌化而提高其下游靶基因的转录,从而影响黏膜上皮细胞的迁移,并最终影响口腔黏膜伤口愈合的分子机制。(4)牙周病致病菌对口腔黏膜伤口愈合的影响及IgY抑菌效果：通过考察口腔内牙周病主要致病菌——具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌,对口腔黏膜伤口愈合的影响发现,两种病原菌通过刺激黏膜上皮细胞的凋亡,从而降低了黏膜上皮细胞的再上皮化速度。为探索抑制口腔内病原微生物安全有效的方法,将两种病原菌免疫蛋鸡并分离纯化得到卵黄抗体(IgY),体外实验表明,抗具核梭杆菌和抗牙龈卟啉单胞菌特异性IgY均能有效地抑制细菌生长,免疫荧光和免疫电镜实验观察到IgY可与两种病原菌高效结合,初步探讨了IgY抑制牙周病致病菌生长的作用机制。体内实验表明,IgY能够抑制牙周病致病菌在口腔内定植引起的牙周病的发展。由于对牙周病致病菌的抑制,IgY可能会加速由致病菌减缓的口腔黏膜伤口愈合。综上所述,受糖尿病影响,口腔黏膜伤口愈合速度显著降低。高糖环境刺激FOXO1转录因子的活化,而提高其下游靶基因CCL20和IL1F9的表达,利用中和抗体降低口腔黏膜上皮细胞产生的过量CCL20和IL1F9,发现细胞的迁移水平显著提高,阐明了高糖环境中过度活化的FOXO1抑制口腔黏膜伤口愈合机制。在正常糖浓度下,FOXO1的敲除通过降低细胞的迁移水平而减缓口腔黏膜伤口愈合速度,证实了FOXO1在正常糖浓度环境中对伤口愈合的必要性。进一步的研究发现,口腔内的具核梭杆菌和牙龈卟啉单胞菌,通过刺激口腔黏膜上皮细胞的凋亡,从而降低口腔黏膜上皮细胞的再上皮化速度,而制备的抗牙周病致病菌的特异性卵黄抗体,能够有效地抑制牙周病致病菌的生长和定植,进而可能加速由牙周病致病菌所减缓的口腔黏膜伤口愈合。