论文部分内容阅读
本文对天府肉鸭的干扰素进行如下系列研究:对天府肉鸭Ⅰ型干扰素基因IFN-αORF进行克隆、鉴定和序列分析;构建IFN-αORF基因原核表达载体;IFN-α原核表达及其生物学活性研究;利用DEF-VSV系统,对稀释复性后的天府肉鸭IFN-α成熟蛋白抗病毒活性进行了研究,获得以下结果:1.天府肉鸭IFN-αORF基因克隆、序列比对分析和蛋白结构预测应用Oligo6.0软件设计了两对加入EcoRⅠ和HindⅢ两个酶切位点的特异性引物,从经过5μg/ml PHA诱导培养的天府肉鸭外周血单核细胞中提取RNA,采用RT-PCR的方法,扩增得到天府肉鸭α干扰素ORF基因的DNA片段。构建了pMD18-T-DuIFNα克隆载体并测序,对测序结果采用DNAStar7.0软件进行序列分析以及与鸭、鸡、鹅等GenBank上α干扰素序列进行了比较。结果显示天府肉鸭与鸭(X84764)ORF基因序列十分相似,其核苷酸同源性达到99.5%,氨基酸同源性为98.4%。与鹅(AY524422)核苷酸及氨基酸同源性分别为96.2%,92.15%;与鸡(NM205427)的核苷酸及氨基酸同源性分别为73.4%、51.3%。同时对该基因所推测的蛋白进行了分析,结果表明天府肉鸭干扰素有2个潜在糖基化位点,8个潜在的磷酸化位点,信号肽切割位点28-29位ANA和FS氨基酸之间,存在跨膜区。2.天府肉鸭IFN-α成熟蛋白基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备构建天府肉鸭IFN-α成熟蛋白基因的重组原核表达载体pET-32a(+)-mDuIFNα,将其转化入大肠杆菌BL21 (DE3)pLysS表达菌株,利用IPTG进行诱导表达,得到大小约为35 kDa的重组融合蛋白,与预期表达的蛋白大小相一致,主要以包涵体的形式存在。最佳表达优化条件为0.2 mmol/L的IPTG,37℃下诱导3~4 h。利用纯化的重组蛋白制备兔抗高免血清,琼脂糖扩散试验效价为1:32。兔抗鸭IFN-α成熟蛋白IgG经硫酸铵盐析和High-Q阴离子交换层析纯化具特异性强的优点。3.天府肉鸭α干扰素成熟蛋白基因原核表达产物的复性及抗病毒活性研究对纯化后的天府肉鸭IFN-α成熟蛋白包涵体采用稀释复性的方法复性,采用DEF-VSV系统初步检测抗病毒活性,干扰素的抗病毒活性约为256U/ml,比活力为646.4U/mg。结果发现,表达的干扰素具有抑制病毒增殖的生物学活性。