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研究背景和目的:血栓闭塞性脉管炎(Thromboangiitis obliterans,TAO),又称为Buerger病(Buerger’s disease),是主要侵犯四肢中小动静脉为主的非动脉粥样性疾病。有关TAO的病因和发病机制在国内外尚不完全清楚。前列环素I2(Prostacyclin I2,PGI2)和血栓素A2(Thromboxane A2,TXA2)是血管内皮细胞合成分泌的与体内凝血功能密切相关的重要生物活性物质。其中PGI2是在胞浆型磷脂酶A2(Cytosolic phospholipase A2,cPLA2)、环氧合酶(Cyclooxygenase synthetase,COX)作用下,由花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)代谢以及前列环素合酶(Prostaglandin synthetase,PGIS)催化合成;TXA2经由血栓素合酶(Thromboxane synthase,TXAS)作用合成,TXA2/PGI2在生理状态下处于动态平衡,当比值失衡可导致血栓形成和组织缺血等。我们前期研究及其他文献报道在TAO模型中血栓素B2(Thromboxane B2,TXB2)和环氧合酶2(Cyclooxygenase 2,COX-2)表达水平显著增高,而6-酮-前列腺素1?(6-Keto-prostaglandin,6-K-PGF1?)表达水平降低。但TAO病理机制中有关环氧合酶1(Cyclooxygenase 1,COX-1)、前列腺素I2(Prostaglandin I2,PGI2)和cPLA2等的作用目前尚未见报道。白三烯(Leukotriene,LTs)作为一有效促炎因子,也是AA的代谢分解产物。5-脂氧酶(5-lipoxygenase,5-LO)是LTs生物合成中的关键酶。白三烯B4(Leukotriene,LTB4)可增强血管内皮与其他细胞的粘附,增加血管通透性;而半胱氨酰白三烯(Cysteinyl leukotrienes,CysLTs)可增强毛细血管的通透性和收缩性。有文献报道在颈动脉、主动脉、腹主动脉和冠状动脉斑块内可见5-LO和LTB4高度表达,而目前尚缺乏LTs与TAO相关性的研究报道。一氧化氮(Nitric oxide,NO)系由三种NO合酶(Nitric oxide synthase,NOS)催化合成,是一种旁分泌因子,可影响血管张力和血小板功能,防止白细胞粘附并减少内膜增生。有研究显示心脏缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)、肺动脉高压、外周动脉疾病、脑血管疾病和冠状动脉疾病等可见诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)和内皮型一氧化氮合酶(Endothelialnitric oxide synthase,eNOS)表达增高;另有少量文献报道在TAO病理机制中NOS活性也有增高。现代药理学研究表明参附注射液(Shenfu injection,SFI)能显著增加血管灌流量、清除氧自由基、改善微循环、保护血管内皮细胞、减轻炎症反应,并具有抗凋亡、抗炎等作用,常应用于心血管疾病。但将SFI应用于TAO的研究很少。因此,本课题将在前期实验基础上,从TXA2/PGI2、5-LO/LTB4和NOS/NO等通路,进一步探索SFI对TAO的保护作用及机制。方法:1.动物模型制作:按我们课题组前期报道方法,将SD大鼠应用月桂酸钠股动脉注射制作TAO动物模型,而假手术(sham)组注入生理盐水,SFI用药组在制作TAO模型后第3天开始给予低中高剂量的SFI进行治疗,连续尾静脉给药15天,其用药量根据其体表面积折算,其余各组给予生理盐水。2.动物体症变化:记录各实验组大鼠体重变化,观察大鼠患肢皮肤颜色和温度变化,有无肿胀、跛行、坏疽和坏疽的程度等情况。3.股动脉组织病理改变:实验结束后取股动脉进行病理切片和HE染色,观察股动脉病理损伤情况。4.血浆相关指标的测定:⑴用放射免疫法测定血浆中TXB2和6-K-PGF1?含量。⑵ELISA检测血浆中LTB4和LTC4含量。⑶Griess法检测NO含量。5.凝血四项测定和血流变指标:由南昌大学第二附属医院代为检测。6.基因水平分析:Q-PCR检测大鼠TAO股动脉TXAS、PGIS、COX-1、COX-2、cPLA2、5-LO、LTA4H、LTC4S、iNOS和eNOS等mRNA表达变化。7.蛋白水平分析:蛋白印迹检测TAO股动脉TXAS、PGIS、COX-1、COX-2、cPLA2、5-LO、LTA4H、iNOS和eNOS等蛋白表达情况。8.免疫组化检测TXAS、PGIS、COX-1、COX-2、cPLA2和LTC4S在股动脉的表达分布。结果:1.SD大鼠股动脉注射5%月桂酸钠溶液约10-15min后,造模肢体膝关节以下及足爪部呈现苍白,继而青紫,足部肿胀和皮肤温度降低,足背动脉搏动减弱或消失等症状。第二天大鼠造模侧后肢均出现不同程度的缺血,造模侧的足趾部青紫继而发黑并向上发展,最后形成坏疽和木乃伊化。部分大鼠表现为患肢疼痛、跛行、拖曳现象,15天后其患肢呈现典型的TAO症状。2.从第2天开始,TAO模型组和各剂量SFI组大鼠进食量和活动量减少;在造模第3天,与sham组相比,TAO模型组大鼠体重明显降低(p<0.05)。从尾静脉给药第6天后,各剂量SFI组大鼠体重与模型组相比均显著增加(p<0.05),其中以中、高剂量组体重上升较快。3.Sham组大鼠患肢足部没有任何坏疽症状,而TAO模型组和低、中和高剂量SFI组大鼠均有不同程度的坏疽症状,TAO模型组大鼠坏疽程度最为严重,Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ分别有3只、3只和2只,而各剂量SFI组大鼠患肢的坏疽程度较TAO模型组均有不同程度减轻。与sham组相比,TAO模型组大鼠患肢坏疽程度显著增加(p<0.001);与模型组相比,中剂量和高剂量SFI组大鼠患肢的坏疽程度明显减少,以中剂量组效果最显著(p<0.01)。4.HE染色结果显示,sham组大鼠股动脉内膜光滑,内部弹性薄层完好,无剥离和脱落现象,内皮细胞和平滑肌细胞排列有序,血管壁无炎性细胞浸润。TAO模型组大鼠股动脉可见内部弹性薄层基本完好,但不如sham组规则,沿弹力层可见炎性细胞浸润,在血管腔中可见新鲜血栓和组织血栓,而SFI各剂量组股动脉管腔闭塞程度均不同程度减轻,血栓形成、炎性细胞浸润减少,其中以中剂量组股动脉闭塞程度最轻。5.凝血四项结果显示,TAO模型组大鼠血浆纤维蛋白浓度(Fibrin concentration,FIB)较sham组升高,而SFI低、中、高剂量组均显著降低TAO大鼠血浆FIB的水平(p<0.05);TAO模型组大鼠血浆凝血酶原时间(Prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(Activated partial clotting time,APTT)和凝血酶时间(Thrombin time,TT)水平较sham组降低,SFI各剂量组能显著增加TAO大鼠血浆中PT、APTT和TT的含量(p<0.05)。6.血流变学结果显示,TAO模型组大鼠血液国际标准化比率(International normalized ratio,INR)、凝血酶原活动度较sham组表达降低,而SFI各剂量组能显著增加TAO大鼠血液INR和凝血酶原活动度(p<0.05)。TAO模型组血液中D-二聚体、红细胞刚性指数(RBC rigidity index,ERI)、红细胞聚集指数(Red cell aggregation index,EAI)、红细胞压积、全血还原粘度(低切和高切)、全血粘度(1/S、30/S和200/S)和血浆粘度较sham组明显增加,而SFI各剂量组血液中D-二聚体、ERI、EAI、红细胞压积、全血还原粘度(低切和高切)、全血粘度(1/S、30/S和200/S)和血浆粘度较TAO模型组显著降低(p<0.05)。7.与sham组相比,TAO模型组大鼠血浆TXB2含量明显增高(p<0.001),且SFI作用呈剂量依赖性;相反,TAO模型组大鼠血浆中6-K-PGF1?含量与sham组相比明显降低(p<0.001),且SFI呈剂量依赖性的增加TAO大鼠血浆中的6-K-PGF1?的含量。8.TAO模型组大鼠血浆LTB4和LTC4含量与sham组相比显著增加(p<0.05),与TAO模型组相比,SFI低、中和高剂量组大鼠血浆中LTB4含量显著降低,其中以中剂量组最低(p<0.05),而LTC4含量无显著性差异(p>0.05)。9.TAO模型组大鼠血浆中NO含量与sham组相比显著增加(p<0.001),与模型组相比,不同浓度的SFI均可降低TAO大鼠血浆中的NO的含量,差异有统计学意义(p<0.01),其中以SFI中剂量组NO含量最低。10.与sham组相比,TAO模型组大鼠股动脉中TXAS、COX-1、COX-2 cPLA2、5-LO、LTA4H、LTC4S和iNOS mRNA和蛋白表达显著增加(p<0.01),低、中和高剂量SFI不同程度的降低了TXAS、COX-1、COX-2和cPLA2 mRNA和蛋白的表达(p<0.05)。而TAO模型组大鼠股动脉中PGIS和eNOS mRNA和蛋白表达与sham组相比明显降低(p<0.05),SFI低、中和高剂量组大鼠股动脉PGIS和eNOS mRNA和蛋白表达较TAO模型组显著增加(p<0.05)。结论:1.成功复制TAO模型大鼠,SD大鼠股动脉注射5%月桂酸钠溶液15天后其患肢呈现典型的TAO症状。2.SFI可增加TAO大鼠体重,减轻坏疽程度和管腔闭塞程度,表明SFI对TAO模型大鼠具有治疗作用。3.SFI通过影响凝血四项以及血流变指标,改善凝血功能和血流状况,发挥治疗TAO模型大鼠作用。4.SFI对TAO大鼠治疗作用与其调控TXA2/PGI2平衡有关,其机理可能涉及其对cPLA2/COX/TXAS和PGIS信号途径影响。5.SFI对TAO大鼠治疗作用与其降低LTB4含量有关,其机理可能涉及其下调其合成酶5-LO和LTA4H的表达。6.SFI对TAO大鼠治疗作用与其调节NO含量有关,其机理可能涉及下调iNOS和上调eNOS的表达,使NO含量保持合适的浓度。