猪IL-15与PRRSV ORF5基因真核表达质粒的构建及其免疫原性分析

来源 :东北农业大学 | 被引量 : 2次 | 上传用户:zippomu
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本实验分别将(猪繁殖与呼吸综合征病毒)PRRSV ORF5基因与猪IL-15基因亚克隆至pVAX1真核表达载体中,构建了两个重组真核表达质粒pVAX1-PRRSV ORF5和pVAX1-pIL-15。通过脂质体转染法将pVAX1-PRRSV ORF5和pVAX1-pIL-15转入Vero细胞中进行了表达,试验结果表明,两个基因都可以在体外进行表达,且表达的蛋白可以被PRRSV ORF5和pIL-15多克隆抗体所检测。以pVAX1-PRRSV ORF5和pVAX1-pIL-15重组真核表达质粒免疫小鼠,分为7个组,分别是pVAX1-PRRSV ORF5单独免疫组、pVAX1-pIL-15单独免疫组、pVAX1-PRRSV ORF5(100μg)与pVAX1-pIL-15(100μg)联合免疫组、pVAX1-PRRSV ORF5(100μg)与pVAX1-pIL-15(200μg)联合免疫组、pVAX1-PRRSV ORF5(100μg)与pVAX1-pIL-15(50μg)联合免疫组、pVAX1空载体对照组和PBS对照组。利用淋巴细胞转化试验、酶联免疫吸附试验、流式细胞仪技术对不同处理组小鼠的各项免疫指标进行了检测。试验结果表明,各免疫组小鼠的各项免疫指标均比pVAX1空载体对照组和PBS对照组高,加入pIL-15的结果尤为显著。在淋巴细胞转化试验和CD4+、CD8+细胞数量的变化及小鼠血液中IFN-γ的检测试验中,加pIL-15中剂量(100μg)组的效果最为明显,其次是加pIL-15小剂量(50μg )组,加pIL-15大剂量(200μg)组的效果差于以上两组,但也比pVAX1-PRRSV ORF5单独免疫组效果明显。而酶联免疫吸附试验检测抗PRRSV ORF5 IgG的结果显示,加pIL-15大剂量(200μg)组的免疫效果优于其他各组。同时在不同时间点收集组织样品,通过PCR检测pVAX1-PRRSV ORF5质粒在小鼠体内的动态分布情况。结果表明,肌肉注射核酸疫苗后,pVAX1-PRRSV ORF5迅速分布到小鼠其他组织器官中,在免疫后3 h即可在脑组织、心脏、肝脏、肺脏、肾脏中检测到,一直持续到免疫后42天。本实验还构建了二个pGEX-6p-pIL-15原核表达质粒,二个质粒分别缺失了pIL-15 N端29 aa和48 aa信号肽序列。在大肠杆菌中获得了高效表达的pIL-15蛋白。纯化后蛋白免疫新西兰大白兔获得兔源多克隆抗体。酶联免疫吸附试验和免疫荧光结果表明pIL-15蛋白与多克隆抗体均具有生物学活性。综上,本研究首次将pIL-15基因与PRRSV ORF5基因质粒联合免疫。实验结果表明pIL-15基因作为PRRSV ORF5抗原基因分子佐剂,不但能促进机体的细胞免疫应答,而且能够提高机体体液免疫应答,进而提高了机体的免疫反应。为进一步研究pIL-15生物活性提供了数据,同时为新型免疫增强型抗病毒疫苗的研究提供了理论基础。
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