酶制剂是工业生物技术快速发展的基石,设计高效稳定的酶制剂是工业生物技术时代需要攻克的关键科学问题。近年来,蛋白质工程技术的快速发展形成了多种改造策略,然而受到酶分子结构与功能关系认识的局限性影响,常常达不到预期效果。生物大数据时代的到来,促进了基于结构生物信息学指导的理性设计新策略的诞生与快速发展。该策略以蛋白质家族为分析单位,结合酶分子结构与功能关系的分析,可有效降低序列空间搜索强度,进而实现“小而精”杂合体文库的构建。本文基于结构生物信息学技术,对GH11(Glucoside Hydrolase)家族耐碱/耐盐木聚糖酶进行了序列结构等深入分析,探究了耐碱酶/耐盐酶的分子表面特性,结合分子表面带电残基序列谱的绘制,定位了 TlXynA(Thermomyces lanuginosus Xylanase A)的9个表面带电残基,通过不同数目突变,成功改善了7lXynA的耐碱性和耐盐性,并对相应策略应用推广于GH12家族。具体内容如下:1.GH11家族耐碱酶/耐盐酶的结构生物信息学分析酶分子活性架构关键氨基酸残基决定了酶分子结合与催化断键的效率,而其分子表面带电残基对酶分子性质也会产生重要影响,主要涉及耐盐性、pH耐受性和离子变性剂耐受性等。本文对GH11家族耐碱酶/耐盐酶进行了结构生物信息学分析,发现7lXynA与耐碱酶/耐盐酶的分子表面性质存在明显差异。通过序列比对发现7lXynA的分子表面带电残基大多对应其它酶的N/Q/S/T等中性不带电残基,这可能是该酶产生功能差异的结构基础,如耐碱性/耐盐性的差别等。因此,结合分子表面序列谱的绘制,分析酶分子表面功能残基位点的突变频率,确定了 77XynA分子表面的9个带电残基作为突变位点,并确定了不同数目的组合突变,为实验指明了方向。2.系列TlXynA突变体的耐碱性功能表征将TlXynA分子表面D/E残基突变为同家族碱性酶分子的相关残基。构建大肠杆菌异源表达体系,实现相关蛋白质异源表达。通过酶活、动力学参数、DSC、耐碱性等性质的测定,发现分子表面带电残基的突变可以影响T7XynA的表达量、酶活、热稳定性、耐碱性等,而且不同数目的组合突变对酶分子性质的影响存在差异。77XynA分子表面过多负电残基不利其耐碱性,通过有目的突变可以改善相关性能。其中突变体aM3(E63N-E109N-E31S-D143S)的耐碱性改善最为显著,pH1 1.0时耐受性提高了 55%。3.系列TlXynA突变体的耐盐性功能表征结合结构生物信息学分析,将7LXynA表面的K/R残基向电负性残基方向突变,以期望改善其耐盐性能。经分子生物学相关实验测定,证实TlXynA的分子表面正电残基确实对耐盐性产生不利影响,将其改为负电或极性残基,可以明显改善其耐盐性。突变体hM1(R116D-R161S)的耐盐性改善最为显著,可耐受5M的NaCl和3M的Na2S04。然而,通过两个表面带电残基的突变未能改善TlXynA对离子变性剂SDS的耐受性。4.耐碱性设计策略在GH12家族的应用推广GH12家族是结构域最简单的纤维素酶家族,与GH11家族同属于GH-C超家族。因此,为了验证TLXynA耐碱性改造策略的普适性,以GH12家族纤维素酶TrCe112A为研究材料,构建了两个耐碱突变体。经测定,两突变体酶活损失较大,耐碱性未明显提高,但却引起了耐酸性与产物谱的变化。相关数据间接表明分子表面带电性质的变化可以影响酶分子的功能性质。在今后研究中,寻找更丰富的参照信息、确定更多热点残基,可能实现TrCel12A耐碱性的改善。