金线莲是兰科(Orchidaceae)开唇兰属(Anoectochilus)的多年生植物。其中,福建金线莲(Anoectochilus roxburghii)和台湾金线莲(Anoectochilus formasanus)因含有丰富的黄酮类等药用成分,被用作药用植物。近年来,由于过度采集造成野生金线莲资源匮乏,需靠人工栽培满足市场需求,然而人工栽培金线莲的药效低于野生植株。研究药效成分合成关键限速酶基因的表达,可通过栽培条件的调节,促进药效成分的合成和积累,提高人工栽培金线莲药用价值。黄酮类化合物是金线莲最主要的药效成分,通过苯丙氨酸途径合成,而苯丙氨酸氨解氨酶(Phenylalanine Ammonia-lyase,PAL)即是这一途径的限速酶。在其他植物上,有PAL基因表达受NaCl等条件诱导的报道。辣椒红素具有很强的抗氧化作用,是金线莲含有的保健成分,合成途径中的限速酶是辣椒红素合成酶(Capsaicin synthase,CCS),其基因表达可受NaCl和光质条件诱导。金线莲所属的兰科开唇兰属没任何物种做过基因组测序,本研究依据转录组学测序数据分析拼接福建金线莲和台湾金线莲全长转录本并设计特异PCR引物,扩增两种金线莲PAL和CCS基因的开放阅读框序列和基因组序列,经比对分析、亚细胞定位和转化验证后,用实时定量PCR测定不同诱导条件下PAL和CCS基因的相对表达水平,以期通过人工栽培条件对这两个基因表达的诱导,促进药效成分的合成和积累,改善人工栽培金线莲的药用价值。主要结果如下:(1)根据转录组学测序数据分析拼接全长转录本设计的PCR引物,扩增分析福建金线莲和台湾金线莲的PAL和CCS基因的cDNA和DNA序列,并进行比对分析。结果表明,PAL和CCS基因在两种金线莲之间高度同源。两种金线莲PAL基因全长2733 bp,开放阅读框长2148 bp,编码715个氨基酸,推导蛋白具有典型的PAL结构和催化活性位点。福建金线莲CCS基因开放阅读框长1461 bp,编码486个氨基酸;台湾金线莲CCS基因开放阅读框长1458 bp,编码485个氨基酸。同源比对、蛋白质结构预测、进化树分析、异源表达都证明,我们克隆的序列确为台湾金线莲和福建金线莲的PAL和CCS基因的ORF和基因组序列。两种金线莲的PAL蛋白均定位于细胞核,虽然与早先关于植物次生代谢的认识有差异,但也为新近的一些报道所证实。由此推测,黄酮类化合物种类繁多,除作为植物次生代谢产物而外,可能还存在未知的新功能。(2)在100 mmol/L NaCl处理下,两种金线莲PAL基因的表达均显著上调,福建金线莲在处理8 h达到最高,达到处理前的7.49倍;台湾金线莲在处理4 h达到最高,为处理前的81.53倍。结合本实验室前期在相同条件下的含量测定结果,说明在人工栽培过程添加适量的NaCl,可诱导PAL基因上调表达,促进两种金线莲黄酮类化合物的积累,增加其总黄酮含量。而且,增加的总黄酮进入黄酮醇支路和花青素支路,提高两种金线莲的药用价值。(3)在100 mmol/L NaCl诱导下,福建金线莲CCS基因的表达除诱导之初(1 h)有上升趋势外,4 h后即开始下调;而台湾金线莲CCS基因的表达则显著上调,且上调幅度很大。紫外光诱导,两种金线莲CCS基因的表达呈相反趋势,福建金线莲上调,而台湾金线莲却一直呈下降趋势。在红光诱导下,福建金线莲和台湾金线莲CCS基因的表达出现波动,不同的时间点表现不一。综上所述,PAL和CCS基因分别在福建金线莲和台湾金线莲黄酮类化合物和辣椒红素合成过程中起关键作用。在金线莲人工栽培过程中,添加适量的NaCl,可上调PAL基因的表达,促进黄酮类化合物的积累,增加总黄酮含量,其中尤以药效和保健作用最好的黄酮醇和花青素含量增加最多。故在实际的生产应用中,可在培养条件中适当增加NaCl的含量,以提高金线莲的药用价值。然而,两种金线莲CCS基因的表达,对NaCl、紫外光和红光诱导的响应不一,尚需进一步深入研究。