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先天性抗病毒因子在机体抗病毒感染的免疫应答过程中起着重要作用,是当前抗病毒免疫研究的热点问题。研究表明,锌指蛋白也是一种先天性抗病毒因子,在机体的免疫系统扮演着重要角色。锌指蛋白可以调节细胞因子如白细胞介素、干扰素的表达,并直接调控淋巴细胞的生长和分化。在先天免疫应答过程中,锌指蛋白直接或间接发挥抗病毒作用。尽管如此,在禽类上锌指蛋白的研究几乎是一片空白,对其结构和功能一无所知。如果能通过研究禽锌指蛋白的功能,筛选到一些在抗感染免疫中发挥重要功能的锌指蛋白,将可能为新药的开发或禽类疫病的防控提供新的思路,因此我们开展了以下几方面内容的研究。1)新城疫病毒感染对多种鸡源锌指蛋白表达的影响在前期研究中,本实验室通过高通量测序获得了 NDV感染CEF细胞后锌指蛋白的表达谱。在此基础上,本研究筛选了 10种在病毒感染后表达量发生明显变化的锌指蛋白进行后续研究。依据GenBank预测的锌指蛋白基因序列,首先初步设计了检测锌指蛋白mRNA水平的RT-qPCR引物,对NDV感染DF-1细胞中10种锌指蛋白表达量的变化情况进行检测。结果显示,chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1三种锌指蛋白在病毒感染后表达下调,在后期又明显的上调,说明这三种锌指蛋白可能参与了病毒感染过程。随后,我们从CEF细胞的cDNA样品中扩增出上述三种锌指蛋白的完整基因序列并进行生物信息学分析。鸡的chZC3HAV1、chZC3H6与其他禽类的同源基因亲源性较近,其次是爬行动物,而与哺乳动物亲源性最低,而鸡的chZEB1蛋白在进化上与其他禽类哺乳动物、爬行动物的亲源性都很高,这说明ZEB1在进化上非常保守。结构域预测结果显示鸡源ZC3HAV1、ZC3H6和ZEB1蛋白具有和人源蛋白类似的功能结构域,其锌指结构在进化上是相对保守的,推测鸡源和人源锌指蛋白具有相似的功能。2)鸡锌指蛋白chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1的抗病毒功能的初步鉴定为了确认chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1是否参与病毒感染后宿主细胞的抗感染免疫应答过程,本研究对上述三种锌指蛋白的抗病毒功能进行了初步鉴定。首先,通过已经获得的chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1基因序列对qPCR检测引物和体系进行优化,最终获得了灵敏性高、特异性好、分别针对三种锌指蛋白的RT-qPCR检测方法。在对多种细胞和鸡组织脏器中的锌指蛋白进行定量检测,发现三种锌指蛋白广泛表达于鸡的组织细胞中,脾脏和法氏囊中的表达量都相对较高。病毒感染试验结果显示,在NDV感染中后期,chZC3HAV1、chZEB1表达量大幅上升;AIV感染能强有力刺激chZC3HAV1的上调表达。过表达chZEB1实验结果表明,chZEB1不能抑制NDV的增殖,说明chZEB1可能并不直接参与抗感染的免疫应答,有可能是参与特异性免疫应答过程中。过表达chZC3HAV1发现,chZC3HAV1对NDV的增殖抑制能力不强,却能够有限抑制AIV的增殖。3)chZC3HAV1抑制病毒增殖的机制研究本研究对chZC3HAV1抗病毒功能做了更进一步的研究。首先,通过过表达chZC3HAV1,我们发现chZC3HAV1具有很强的抗ATV作用而对NDV抗病毒能力较弱。通过比较AIV和NDV感染后细胞不同时间点中chZC3HAV1的表达,我们发现NDV不能在感染早期诱导chZC3HAV1的基因上调,而整个AIV感染过程中,chZC3HAV1表达量一直上调。后续体内实验证实了这一现象,NDV感染早期,鸡组织脏器中的chZC3HAV1表达量并未出现明显上调。由于chZC3HAV1是一种早期抗病毒因子,推测NDV感染后chZC3HAV1表达的滞后是其不能有效发挥抗NDV作用的因素之一。本研究进一步研究了 chZC3HAV1的抗病毒机制。通过双荧光素酶检测系统,我们发现过表达chZC3HAV1不能激活NF-κB、IRF-3/7、IFN-β等信号通路,间接证明chZC3HAV1并不能和人源ZC3HAV1基因一样,通过与RIG-Ⅰ的相互作用增强干扰素信号,这表明鸡天然缺失RIG-Ⅰ造成了部分先天性免疫因子功能的缺陷。在chZC3HAV1过表达细胞中和上清中,病毒RNA的表达量远远低于对照组,暗示chZC3HAV1可能是直接识别病毒RNA并招募免疫因子降解病毒RNA发挥抗病毒作用的,这一推论有待于后续实验证明。