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目的:观察PC12细胞氧糖剥夺/复氧（OGD/R）后,BMSCs来源的外泌体对轴突再生的作用,及对磷酸酶和张力蛋白同源蛋白（PTEN）、微管蛋白3（β-tubulinⅢ）等的表达的影响,探讨BMSCs来源的外泌体对PC12细胞OGD/R后可能的轴突再生的作用及机制。方法:实验分为三部分进行。第一部分:大鼠原代BMSCs的提取及外泌体的提取与鉴定。10只SDF健康清洁雌性大鼠,颈椎脱臼法处死,取出双侧股骨、胫骨,使用无菌PBS冲洗三次。眼科剪剪去股骨、胫骨两端,使骨髓腔暴露,用装有基础培养基的5ml无菌注射器于双侧反复冲洗骨髓腔,冲出骨髓于离心管中,至骨髓腔变白。以1200r/min离心5min,弃去上清,以基础培养基接种于培养瓶中,置于恒温箱中培养。接种后的BMSCs于48h后半量换液,后每3d全量换液,至融合达80%,胰酶消化后培养基中和,移入离心管,1200r/min离心5min,弃上清,用基础培养基重悬细胞,适当比例接种于培养瓶中。取融合达80-90%的第3代BMMSC,将培养基换为无外泌体培养基,继续培养48h。收集培养基,分别以300×g离心10min,2000×g离心20min,10000×g离心30min,弃去死细胞和碎片。收集上清,以100000×g离心90min,弃去上清,以PBS重悬即可获得外泌体。以免疫印迹试验（Western blot）检测TSG101、CD9的表达,透射电镜观察并鉴定外泌体。第二部分:PC12细胞的培养及氧糖剥夺/复氧后典型时间点的选择。用PC12基础培养基将PC12细胞接种于培养瓶中,每3天换液一次。待培养瓶底部细胞融合至80%-90%时,将PC12细胞进行传代,将传至第3-5代的细胞用于实验。将PC12细胞分为对照组、氧糖剥夺6h/复氧3h组、氧糖剥夺6h/复氧6h组、氧糖剥夺6h/复氧12h组、氧糖剥夺6h/复氧24h组。复氧后从24孔板中取出长有细胞的盖玻片,处理后于荧光显微镜下拍照观察,观察各组细胞的荧光强度并观察轴突长度。复氧后提取各组细胞蛋白,测定各组蛋白浓度。Western blot法检测各组蛋白β-tubulinⅢ的表达情况。从中选取合适的时间点指标进行以下实验。第三部分:选取典型时间点后,将PC12细胞分为三组:对照组、氧糖剥夺6h/复氧24h组（模型组）、氧糖剥夺/复氧24h组+外泌体组（治疗组）。CCK-8法测定各组细胞活力。给与外泌体干预后,分别从24孔板中取出不同组别长有细胞的盖玻片,处理后于荧光显微镜下拍照观察,观察各组细胞的荧光强度并观察轴突长度。复氧后提取各组细胞蛋白,测定各组蛋白浓度。Western blot法检测各组蛋白PTEN、β-tubulinⅢ、PI3K、AKT的表达情况。以上进行统计学分析。结果:第一部分:1.BMSCs的细胞形态学观察:原代细胞接种后光镜下以圆形、大小不一的圆形混杂细胞为主。1d后可见极少量细胞贴壁,后贴壁细胞逐渐增加,细胞形态较一致,呈梭形,出现细胞集落排列。7d后可见细胞融合成片,细胞排列更有规律性,呈旋涡状排列。BMSCs来源的外泌体的观察与鉴定:透射电镜观察BMSCs来源的外泌体直径约为30-110nm,呈圆形、椭圆形或茶托样的囊泡,周围有完整的膜结构。Western blot法检测到外泌体中TSG101、CD9呈阳性表达。第二部分:分组实验后的结果显示:光镜下OGD6h/R24h后PC12细胞的轴突最短。经Western blot法检测OGD/R后PC12细胞中β-tubulinⅢ表达。同对照组相比,我们发现OGD6h/R3h组,OGD6h/R6h组,OGD6h/R12h组,OGD6h/R24h组中β-tubulinⅢ表达逐渐减少,差异有统计学意义（#P<0.05）,且OGD6h/R24h组β-tubulinⅢ表达减少最为明显。因此我们可以得出结论:OGD6h/R24h组与对照组,OGD6h/R3h组,OGD6h/R6h组,OGD6h/R12h组相比,β-tubulinⅢ蛋白的表达最少,且差异有统计学意义（*P<0.05）。免疫荧光染色发现,同对照组相比,OGD6h/R3h组,OGD6h/R6h组,OGD6h/R12h组,OGD6h/R24h组中的轴突相关蛋白β-tubulinⅢ荧光强度明显低于对照组,随着复氧时间的延长,荧光强度逐渐变低,OGD6h/R24h组荧光强度达到最低峰（P<0.005）。上述结果表明PC12细胞OGD6h/R24h后,轴突长度最短,且轴突相关蛋白β-tubulinⅢ表达最少,此时间点符合下一步实验要求,在以下实验中定为模型组。第三部分:分组实验后的结果显示:CCK-8结果显示:对照组细胞活力最高,OGD6h/R24h+外泌体组次之,模型组细胞活力最低。与对照组相比,模型组、OGD6h/R24h+外泌体组细胞活力降低,两两比较有统计学意义（#P<0.005）,与模型组相比,对照组、OGD6h/R24h+外泌体组细胞活力增高,两两比较有统计学意义（*P<0.005）,这说明加入外泌体处理后,可以显著提高细胞的存活率。经Western blot法检测不同分组中PC12细胞中β-tubulinⅢ、PTEN、PI3K表达。同对照组相比,治疗组、模型组的PTEN表达量明显增加,PTEN表达量差异有统计学意义（#P<0.05）;同模型组相比,对照组、治疗组PTEN表达量明显减少,PTEN表达量差异有统计学意义（*P<0.05）,这说明外泌体虽不能使OGD/R后的PC12细胞PTEN含量降至正常水平,但可以抑制PTEN的表达,使其表达水平下降。同对照组相比,治疗组、模型组的PI3K表达量明显减少,PI3K表达量差异有统计学意义（#P<0.05）;同模型组相比,对照组、治疗组PI3K表达量明显增加,PI3K表达量差异有统计学意义（*P<0.05）;同对照组相比,治疗组、模型组的AKT表达量明显减少,PI3K表达量差异有统计学意义（#P<0.05）;同模型组相比,对照组、治疗组AKT表达量明显增加,AKT表达量差异有统计学意义（*P<0.05）。这表明外泌体可以促进OGD/R后的PC12细胞PI3K、AKT的表达。同对照组相比,治疗组、模型组的β-tubulinⅢ表达量明显减少,β-tubulinⅢ表达量差异有统计学意义（#P<0.05）;同模型组相比,对照组、治疗组β-tubulinⅢ表达量明显增加,β-tubulinⅢ表达量差异有统计学意义（*P<0.05）。这表明外泌体可以促进OGD/R后的PC12细胞β-tubulinⅢ的表达。将对照组、模型组、治疗组进行荧光染色,结果显示:与对照组相比,治疗组的荧光强度较低,但与模型组相比,治疗组的荧光强度明显增强,且三组数据比较有统计学意义（P<0.05）,证明外泌体对损伤后的轴突生长有较强的促进作用。结论:BMSCs来源的外泌体可以促进氧糖剥夺/复氧后PC12细胞轴突长度的延伸、轴突相关蛋白β-tubulinⅢ的表达以及抑制通路抑制蛋白PTEN的表达,可能通过抑制PTEN-PI3K通路从而促进轴突的再生与神经功能的恢复。