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原始生殖细胞（Primordial Germ Cells,PGCs）是配子的前体,精子和卵子的祖细胞,负责代与代之间传递遗传和表观遗传信息,确保物种的延续和生存,并且在发育生物学研究、物种保护以及养殖生产领域有着极其重要的意义。鸟类的PGCs因为其独特的发育特点使其成为保护濒危动物和种质资源恢复的有力工具,然而由于体内分离的PGCs数量有限,诱导体系不成熟使其难以大量获取,限制了其应用。其中的关键问题在于影响PGCs发生具体因素仍不明朗,因此科学家迫切需要剖析和阐明PGCs形成过程中的分子调控机制。近年来,研究者们已经发现了 PGCs发生过程中的众多参与调控的基因、细胞因子、信号通路和表观遗传修饰等因素,本课题组前期研究中已经确定BMP4是鸡PGCs形成中的关键基因,并且全基因组存在DNA和H3K4me2的动态变化,但是其中的具体分子调控机制尚不清楚。而随着基因组学的深入研究,人们愈发认识到基因表达模式中存在多种表观遗传现象同时相互作用从而和其他调控元件构成复杂而有序的遗传分子图谱。所以深入探索DNA和H3K4me2这两种不同表观遗传因素对鸡PGCs形成中的关键基因BMP4的影响和理清这些因素与基因的调控元件互作的模式机制有利于人们更加系统全面地认识鸡PGCs的形成机理。为此,本研究根据鸡生殖细胞上的DNA和组蛋白甲基化的动态变化推测表观遗传因素能够调控关键基因参与PGCs的形成,故首先验证DNA甲基化对PGCs形成的影响并且基于课题组前期在鸡胚胎干细胞（Embryonic Stem Cells,ESCs）、和PGCs上H3K4me2的ChIP-seq以及DNA甲基化测序MBD-seq结果筛选确定PGCs形成中的关键基因—BMP4,利用dCas9系统验证DNA甲基化对BMP4的靶向调控作用,进而探索DNA甲基化、H3K4me2和转录因子如何共同调控BMP4转录参与PGCs形成的机制。该研究为阐明PGCs发生过程的表观遗传通路,完善优化PGCs诱导形成体系,推广PGCs的研究应用提供思路和依据。研究结果如下:（1）DNA甲基化调控PGCs的形成通过前期ESCs和PGCs中转录组数据分析DNA甲基化修饰酶的表达变化,确定Dnmt3A和Tet1是影响DNA甲基化的关键修饰酶;分别构建了Dnmt3A和Tet1的Dnmt3A-shRNA1、Dnmt3A-shRNA2和Dnmt3A-shRNA3,以及Tet1-shRNA1、Tet1-shRNA2 和Tet1-shRNA3 干扰载体,转染 DF1 细胞qRT-PCR分析Dnmt3A-shRNA1和Tet1-shRNA3干扰活性最佳（P<0.01）,选择作为用于后续验证实验。体内外验证DNA甲基化对PGCs形成的影响,体外实验中干扰Dnmt3A组第4d出现大量类胚体聚团,6d出现大量即将细胞破裂的类胚体,而干扰Tet1第4d和6d都未出现类胚体;Dot-blot检测发现干扰Dnmt3A组甲基化水平显著降低（P<0.05）,干扰了 Tet1后DNA甲基化水平小幅上升;qRT-PCR检测干扰Dnmt3A组6d后Cvh、C-kit、BMP4、Blimp1和Lin28a表达显著上升（P<0.05）,而干扰了Tet1后各基因组出现显著下调（P<0.05）;而流式细胞分析发现干扰Dnmt3A后PGCs形成率显著提升（P<0.05）,干扰Tet1后的PGCs形成率显著下调。体内实验中qRT-PCR检测发现干扰Dnmt3A组BMP4、Cvh和C-kit的表达都显著提高（P<0.05）,Blimp1和Lin28a的表达极显著上调（P<0.01）,干扰Tet1后Cvh、C-kit、BMP4、Blimp1和Lin28a都发生了极显著下调（P<0.01）;流式细胞仪分析发现干扰Dnmt3A后PGCs形成效率显著提升（P<0.05）,干扰Tet1后PGCs形成效率显著下调（P<0.05）。以上结果表明DNA甲基化抑制PGCs的形成,DNA去甲基化促进PGCs的形成。（2）PGCs形成中DNA甲基化和H3K4me2参与调控BMP4基因对ESCs和PGCs的ChIP-seq以及MBD-seq结果进行联合分析,筛选得到PGCs形成过程中受DNA甲基化和H3K4me2调控的TGF-β通路中关键基因BMP4并作为靶基因研究对象。成功构建pBMP4-EGFP-N1载体,验证具有启动活性;成功构建BMP4不同长度缺失片段启动子-basic载体,双荧光素酶报告系统验证pGL3-613极显著高于pGL3-508和pGL3-281（P<0.01）,说明508-613bp为BMP4的核心启动子区。生物信息学方法预测BMP4核心启动子区的CpG岛并通过重亚硫酸盐测序的方法比较在CEFs、ESCs和PGCs中DNA甲基化水平,结果发现ESCs中BMP4启动子区平均DNA甲基化水平显著高于PGCs（P<0.05）;基于组蛋白H3K4me2的ChIP-qPCR发现PGCs中BMP4启动子上H3K4me2富集水平显著高于ESCs（P<0.05）,并且主要集中于核心启动子区;进一步通过qRT-PCR检测发现PGCs中BMP4和Smad1显著高于ESCs（P<0.05）,Bmpr1、Bmpr2和C-kit则极显著高于ESCs（P<0.01）;通过Western Blot检测BMP4信号下游磷酸化p-Smad1/3/5复合蛋白在PGCs中显著高于ESCs（P<0.05）。以上结果说明PGCs形成关键基因BMP4在ESCs和PGCs表达上升伴随着启动子区DNA甲基化水平下降和H3K4me2的富集增多。（3）CRISPR-dCas9介导的TET1靶向BMP4启动子DNA去甲基化促进PGCs形成针对BMP4启动子区CpG岛分别设计三对sgRNA序列,连接至pgRNA-humanized载体重组构建成功sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3引导载体,与dCas9-TET1CD分别组合转染DF1细胞检测激活BMP4效果,经过qRT-PCR检测发现sgRNA和dCas9-TET1CD载体的组合都能极显著增强BMP4表达（P<0.01）,当sgRNA1、2和3混合与dCas9-TET1CD组合共转时BMP4表达达到最高（3.473±0.187）,说明多个sgRNA靶定同一个基因可以达到最佳激活效果。在体外ESCs诱导过程中sgRNA1-3和dCas9-TET1CD共转后通过重亚硫酸盐转化测序发现BMP4启动子区甲基化水平显著下降（P<0.05）,而通过qRT-PCR检测发现BMP4表达极显著升高（P<0.01）,下游信号基因Bmpr1、Smad1表达显著升高（P<0.05）,PGCs的标记基因Blimp1和Lin28a表达量也显著升高（P<0.05）,而Cvh和C-kit的上调更为显著（P<0.01）,而Dnmt3A和Tet1表达无明显差异;Western Blot检测BMP4下游磷酸化p-Smad1/3/5蛋白表达显著上升（P<0.05）;流式细胞仪分析检测PGCs的形成率显著提高（P<0.05）。体内0d尿囊腔注射sgRNA1-3和dCas9-TET1CD后通过qRT-PCR检测BMP4和PGCs形成中的标记基因Cvh、C-kit、Blimp1以及Lin28a表达都显著升高（P<0.05）,Western Blot检测p-Smad1/3/5蛋白显著增加（P<0.05）,流式分析检测发现注射sgRNA1-3和dCas9-TET1CD组的PGCs形成效率显著升高（P<0.05）。以上结果说明靶向BMP4启动子区DNA去甲基化可以增加BMP4表达,促进PGCs的形成。（4）DNA甲基化和组蛋白甲基化拮抗调节BMP4信号参与PGCs的形成通过生物信息学预测BMP4启动子区潜在转录因子LIN54、ZEB1和NFAT5,并通过构建缺失结合位点的核心启动片段连接Basic载体,转染DF1细胞后通过双荧光素酶报告系统检测发现只有在缺失了 ZEB1的结合位点之后启动活性极显著降低（P<0.01）,说明ZEB1是BMP4核心启动子区域的关键转录因子。构建Zeb1的过表达载体之后转染DF1细胞,qRT-PCR检测过表达Zeb1后的Zeb1和BMP4表达量显著上升（P<0.05）,并且Zeb1在体内0-6d的过程中表达逐渐升高;而oe-Zeb1与核心启动片段basic载体共转DF1细胞,双荧光素酶检测BMP4核心启动子片段的启动活性显著升高（P<0.05）,以上结果表明Zeb1作为BMP4转录因子可促进其转录表达。成功构建Dnmt3A和Tet1的过表达载体,与组蛋白去甲基化酶LSD1过表达载体一起共转染DF1细胞后,48h后双荧光素酶报告系统检测发现启动活性极显著下调（P<0.01）,接着转染Tet1和Zeb1的过表达载体96h后再次检测启动活性发生了显著上调（P<0.05）。结果说明DNA甲基化和H3K4去甲基化能够抑制BMP4转录活性,而在DNA去甲基化和转录因子Zeb1能够挽救和增强BMP4的转录活性。ChIP-qPCR检测PGCs细胞发现ZEB1和H3K4me2在BMP4启动子的核心区域都存在富集,干扰了 Dnmt3A时,H3K4me2的富集水平和ZEB1的结合都发生了显著的增加（P<0.05）,CpG岛的DNA甲基化水平显著下降（P<0.05）;而在干扰了组蛋白甲基化酶MLL2后BMP4启动子区的H3K4me2的富集水平和ZEB1的结合都发生了显著的减少（P<0.05）,DNA甲基化水平发生了显著上升（P<0.05）。结果表明DNA去甲基化可以增加BMP4的核心启动子区里H3K4me2的富集和转录因子ZEB1的结合,而H3K4me2去甲基化能够相应的减少H3K4me2和ZEB1的富集和结合,并且DNA甲基化和H3K4me2的富集水平呈拮抗关系,为下一步深入探索表观遗传通路在PGCs形成的具体机制奠定了良好基础。