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背景与目的成功妊娠依赖于受精、着床、蜕膜化、胎盘形成及分娩这一系列事件的有序进行。其中,胎盘作为母体与胎儿特异性营养及代谢产物交换器官,是妊娠正常进行及胎儿健康发育的重要保障。滋养细胞的发育及分化是胎盘形成的关键,胚胎的原始滋养层依次分化出细胞滋养细胞(cytotrophoblast,CT)、合体滋养细胞(syncytiotrophoblast,ST)及绒毛膜外滋养细胞(extravillous trophoblast,EVT),分别发挥分化、分泌及侵袭作用。EVT由CT分化而来,通过侵袭蜕膜甚至深达蜕膜肌层,在替代蜕膜螺旋动脉内皮细胞参与螺旋动脉重塑的同时,与蜕膜细胞通过受体-配体结合方式相互作用,调节蜕膜细胞的生理活性。在母体妊娠免疫的建过程中,EVT可通过与蜕膜细胞的结合,调节蜕膜免疫细胞的免疫活性,从而诱导母体免疫耐受的建立。作为一种半同种移植物,母体的免疫耐受是胚胎能够在母体存活并正常发育的保证。因此,深入研究早孕阶段EVT与蜕膜免疫细胞的分子对话,明确对话对于早孕免疫耐受建立的作用,对于提高胚胎存活率及妊娠成功率均具有重要意义。c-Fos是AP-1家族中Fos亚家族的主要成员,参与细胞分化、侵袭、迁移、凋亡等细胞生理过程的调节,在外周免疫系统、骨骼系统及神经系统均有重要作用。在妊娠中,c-Fos对胚胎的发育及滋养细胞的侵袭有一定作用。c-Fos不仅可以通过调节EVT金属蛋白酶的表达,调节EVT的侵袭及迁移能力,还可以直接调节胚胎脑及骨骼发育,甚至影响胎儿生存,因此全面理解c-Fos在妊娠中的作用,对维持正常妊娠,治疗及预防异常妊娠状态均有一定意义。虽然目前在妊娠系统中,c-Fos与滋养细胞及胚胎发育的研究较为丰富,但是作为一种重要的免疫调节转录因子,c-Fos与妊娠免疫的关系目前未见报道。我们前期的生物信息学预测结果显示,在HLA-G基因上游12kb碱基处的顺式调节原件——增强子L上可能存在c-Fos结合位点,推测c-Fos可能通过调节增强子L的表达,间接调解HLA-G表达,从而影响母体妊娠免疫的建立及维持。综上,本研究拟从生殖免疫角度出发,结合前期生物信息学分析结果,探讨c-Fos对于早孕妊娠免疫的调节及相关机制,为更好理解早孕母胎界面分子互作、了解早孕母体免疫耐受建立的过程提供理论依据,同时为妊娠相关疾病的预防及靶向治疗提供知识基础。材料与方法组织免疫化学检测新鲜正常早孕绒毛中c-Fos表达,细胞免疫荧光检测JEG-3细胞c-Fos表达,设计并构建c-Fos特异性siRNA抑制JEG-3细胞c-Fos表达,PCR及Western Blot检测siRNA抑制效率,划痕实验、Transwell实验、MTT实验鉴定抑制c-Fos表达后JEG-3细胞的侵袭、迁移能力及生物活性改变,进一步验证siRNA系统的有效性,PCR及Western Blot检测c-Fos表达抑制后JEG-3的HLA-G表达变化;转录组高通量测序检测抑制c-Fos表达后JEG-3转录组变化,基因本体分析及通路富集分析挖掘免疫相关基因变化与c-Fos表达的关系;多因子分析法检测抑制c-Fos后JEG-3细胞Th1/Th2相关细胞因子分泌变化;多色流式细胞术检测c-Fos表达抑制JEG-3细胞与外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)共培养后 PBMCs 组分变化。结果(1)ENCODE预测分析显示:HLA-G的上游增强子区域可能存在c-Fos结合位点;(2)绒毛免疫组化及细胞免疫荧光结果显示:c-Fos在正常早孕绒毛及JEG-3细胞系中均有大量表达;(3)siRNA转染JEG-3细胞后PCR及Western Blot结果显示:单独转染三条 c-Fos 特异性 siRNA,c-Fos mRNA 抑制率分别为:c-Fos-homo-685:12%±0.05(P=0.016),c-Fos-homo-816:8%±0.04(P=0.035),c-Fos-homo-1002:25%±0.05(P=0.001)。混合转染三条c-Fos特异性siRNA,c-Fos mRNA抑制率为39%± 0.015(P<0.001),c-Fos 蛋白表达抑制率为:33.86%±0.034(P=0.030)。c-Fos特异性siRNA混合转染方法可以达到预期的c-Fos表达抑制效果;(4)划痕实验、Transwell及MTT实验结果显示:抑制c-Fos表达可以增加JEG-3细胞的迁移(P=0.005)及侵袭能力,但是对JEG-3的细胞活性无显著影响(P>0.05);(5)全转录组高通量测序结果显示:c-Fos可以影响JEG-3多个免疫通路相关基因的表达;(6)多细胞因子检测结果显示:抑制JEG-3细胞c-Fos表达,可以显著降低其IL-6分泌能力(P<0.001),轻微降低其IL-4分泌水平(P=0.015);(7)直接共培养后流式细胞术结果显示:抑制JEG-3的c-Fos表达可以降低JEG-3对于PBMCs免疫抑制的诱导能力;(8)PCR及Western Blot结果显示:抑制c-Fos表达可能不影响JEG-3细胞HLA-G的表达(P>0.05)。结论(1)c-Fos可以抑制JEG-3细胞的侵袭及迁移能力,但是对JEG-3细胞活性无显著影响;(2)c-Fos可能通过调节JEG-3炎性因子分泌,或通过调节其他免疫相关通路的基因表达,促进JEG-3的免疫调节能力。