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第一部分:康复新液对肺纤维化细胞模型的干预研究目的:探讨康复新液对转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β1诱导人胚肺成纤维细胞(MRC-5细胞)模型的干预效果。方法:用10μg/L TGF-β1诱导MRC-5细胞构建肺纤维化细胞模型,用PCR的方法分别检测0 h、48 h和72 h后细胞模型中Ⅰ型胶原(collagenⅠ)、Ⅲ型胶原(collagenⅢ)、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)、层粘连蛋白(laminin,LN)、纤维连结蛋白(fibronectin,FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)这些特异性纤维化蛋白的mRNA表达水平,发现FN、CTGF、Col III mRNA表达水平在48 h已经出现显著升高,LN、α-SMA、Col I mRNA表达水平在72 h出现显著升高,可见MRC-5细胞在48 h开始出现纤维化,72 h时纤维化充分,呈现出一定的时间依赖性;并运用CCK8(cell counting kit-8)法检测康复新液对MRC-5细胞毒性,测得康复新液对MRC-5细胞的最高不致死给药浓度;使用CCK8法测得的康复新安全浓度干预TGF-β1诱导MRC-5纤维化细胞模型,干预时间分别为24 h、48h和72 h,通过PCR的方法检测α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ这6种特异性纤维化因子的mRNA表达水平,比较干预不同时间的效果差别;通过WB方法检测康复新液干预不同时间后TGF-β1诱导MRC-5纤维化细胞模型中α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ这6种特异性纤维化蛋白的表达水平,比较干预不同时间的效果差别。结果:TGF-β1在10ng/m L的质量浓度下72 h时可成功诱导MRC-5发生了纤维化;CCK8法检测以80倍稀释的康复新液对MRC-5细胞为最高不致死稀释倍数;PCR的方法和WB方法检测α-SMA、LN、FN、CTGF、CollagenⅠ、CollagenⅢ这6种特异性纤维化因子的mRNA及蛋白质表达在48 h和72 h有所下降。与阳性药物地塞米松组(Dexamethasone,DXM)的干预效果相当。结论:康复新液可改善由TGF-β1诱导MRC-5细胞纤维化的表型,有望被应用于肺纤维化的治疗。第二部分:康复新液对肺纤维化大鼠模型的干预研究目的:探讨康复新对博来霉素(Bleomycin,BLM)诱导的肺纤维化模型大鼠的干预效果。方法:Wistar大鼠48只,雌雄各半,随机分为对照组、模型组以及模型鼠康复新治疗组、地塞米松阳性对照组,除对照组外,余用博来霉素5 mg/kg气管内一次性滴注复制模型,鉴定模型成功后,使用康复新液和地塞米松进行灌胃治疗,康复新组康复新液治疗剂量为5 ml/kg/d,地塞米松组地塞米松治疗剂量为0.25ml/kg/d,灌注周期为21天。治疗后取大鼠肺组织,做HE和马松染色,显微镜下观察。同时用PCR方法检测肺组织中LN、FN和α-SMA在mRNA的表达情况,运用WB方法检测肺组织中LN、FN和α-SMA的蛋白表达情况。结果:显微镜下观察可见,模型组肺组织纤维化较对照组明显,LN、FN、α-SMA三种蛋白在mRNA水平及蛋白水平表达均有上升;使用康复新和地塞米松治疗后,显微镜下观察可见肺组织纤维化较模型组有明显改善,LN、FN、α-SMA三种蛋白在mRNA水平及蛋白水平表达均有下降。结论:康复新可减轻博来霉素诱导的大鼠肺纤维化,其作用可能与其下调肺组织中层粘连蛋白、纤维连结蛋白和α-平滑肌肌动蛋白表达有关。第三部分:康复新液对肺纤维化模型TGF-β1/Smad信号通路的MMPs/TIMPs调节机制研究目的:探讨康复新液治疗肺纤维化模型有效性机制。方法:在加入诱导剂TGF-β1(10ng/m L)的前1 h(pre 1 h)、后1 h(post 1h)和后3 h(post 3 h)的时间点时加入康复新稀释液,在之后的48 h和72 h两个时间点收取细胞样本,并提取细胞RNA逆转得到c DNA,运用实时定量PCR的方法检测MMP1、MMP3、MMP9、TIMP1、SMAD2、SMAD7、TGF-β1在mRNA水平的表达情况,采用WB的方法检测MMP-1、MMP-3、MMP-9、SMAD2、SMAD7蛋白的表达情况,以GAPDH作为内参,同时设有对照组(Control)。结果:康复新液可以提高TGF-β1诱导肺纤维化细胞模型中MMP-1、MMP-9的蛋白表达,而对MMP-3蛋白的表达影响不显著;康复新液可以提高TGF-β1诱导肺纤维化细胞模型中SMAD2蛋白的表达,但对SMAD7蛋白的表达是抑制的。结论:复新液治疗TGF-β1诱导肺纤维化细胞模型并不是通过TGF-β/Smad这条经典通路发挥作用的。