论文部分内容阅读
毛囊是控制毛发生长的皮肤附属器官,经过周期性的结构改变可以实现自我更新。成熟的毛囊结构复杂,包含角质形成细胞、黑色素细胞及毛乳头细胞（dermal papilla cells,DPCs）等。DPCs由起源于真皮间质的成纤维细胞高度特化而成,在毛囊的周期改变中起到关键作用,即使是体外传代培养的DPCs仍可以继续诱导毛囊形成,促进毛囊生长。围绕DPCs外层的脂肪间充质干细胞（adipose derived stem cells,ADSCs）可以优化毛嚢微环境促进毛嚢生长。ADSCs起源于中胚层,具有多向分化潜能,由于其来源丰富、免疫原性低,近年来在细胞治疗和组织工程方面具有广泛的应用前景。氧气是干细胞微环境的重要组成成分,干细胞生存、维持和行为均离不开氧气的调节。低氧微环境对于促进ADSCs增殖、保持其正常形态和多向分化潜能有重要影响。因此,利用低氧微环境培养ADSCs可以促进毛囊生长。然而这一过程具体涉及哪些分子机制目前尚不清楚,因此深入研究低氧微环境下ADSCs对毛囊生长的促进机制具有非常重要的理论意义。本研究以阿尔巴斯白绒山羊DPCs和ADSCs为研究对象,首先建立ADSCs低氧微环境,研究低氧微环境下ADSCs功能的变化。进一步收集ADSCs条件培养基培养DPCs,观察DPCs生长的变化,并且探究相关生长因子的表达机制,从而为研究毛囊生长原理及其分子机制提供实验依据。一、低氧微环境的建立及其对脂肪间充质干细胞功能的影响为了建立ADSCs低氧微环境,本研究首先检测不同浓度低氧模拟物去铁胺（desferrioxamine,DFO）和氯化钴（cobalt chloride,CoCL2）作用24 h、48 h和72 h对ADSCs增殖活性的影响。结果发现25μM DFO和150μM CoCl2培养ADSCs 48 h的增殖活性最强,因此选择此浓度与时间作为最佳处理条件。与此同时对细胞进行物理低氧培养,与未处理常氧培养的ADSCs比较发现,无论物理低氧培养还是低氧模拟物培养均提高了ADSCs的增殖活性。鉴定低氧微环境中低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1）的表达发现,连续低氧培养24 h、48 h和72h后HIF-1α均有表达,其中48 h表达最高。此外,低氧培养后ADSCs表面标记基因CD44、CD90表达呈阳性,造血干细胞标记基因CD34和CD45表达呈阴性;多能性基因NANOG、OCT4和SOX2不仅在低氧培养后持续表达,而且每个基因的表达量均有提高。与此同时,在物理低氧组中,增殖基因TERT表达增加,促进细胞增殖;抑癌基因p53表达减少,凋亡基因Bcl-2/BAX比例增加,抑制细胞凋亡。以建立好的物理低氧模型为实验对象,检测低氧对ADSCs细胞功能的影响,包括细胞迁移能力、成血管能力以及旁分泌水平。结果显示:低氧微环境下ADSCs的细胞迁移能力更强;在基质胶的作用下,体外培养ADSCs可以形成血管样结构,且无论是单位面积的血管数量还是长度,低氧培养均显著高于常氧培养;此外,低氧条件培养基（hypoxic conditioned medium,Hypo-cm）中含有更多的生长因子VEGF、bFGF和PDGF。二、脂肪间充质干细胞条件培养基对毛乳头细胞生长的影响使用Hypo-cm和常氧条件培养基（normoxic conditioned medium,Nor-cm）培养初级毛乳头细胞（primary hair follicle dermal papilla cells,PHF-DPCs）和次级毛乳头细胞（secondary hair follicle dermal papilla cells,SHF-DPCs）发现,条件培养基特别是Hypo-cm可以显著提高PHF-DPCs和SHF-DPCs的增殖能力,除了EdU阳性细胞率较高外,细胞增殖基因Ki67的表达量也明显高于对照组。细胞周期检测结果显示,使用条件培养基后,进入S期细胞比例明显增多,且周期蛋白CDK2表达增加;此外,细胞凋亡比例减少。这证明条件培养基可以提高PHF-DPCs和SHF-DPCs的增殖活性。PHF-DPCs和SHF-DPCs特异性标志基因ALP检测结果显示,使用条件培养基后,ALP染色情况及活性明显高于对照组。其他特异性标志基因SOX2、α-SMA、NCAM和Version的检测结果显示,使用条件培养基后,特别是Hypo-cm可以提高这些基因的表达。这同样证明了条件培养基可以促进PHF-DPCs和SHF-DPCs的生长,增强其毛囊诱导能力。三、ERK1/2信号通路及HIF-1α调控ADSCs促进DPCs生长的机制通过检测ADSCs分泌生长因子VEGF、bFGF和PDGF所涉及的调控网络发现,低氧微环境会激活ADSCs ERK1/2信号通路,使用ERK1/2抑制剂PD98059处理ADSCs时,会使低氧微环境下提高的生长因子表达降低,这表明ERK1/2诱导了VEGF、bFGF和PDGF的表达。与此同时,HIF-1α在低氧微环境下发挥重要作用,一方面HIF-1α会提高ADSCs中VEGF、bFGF和PDGF表达,且这种提高受到HIF-1α抑制剂YC-1抑制。另一方面,HIF-1α会抑制ADSCs中BMP2、BMP4和BMP7表达,其中BMP7在过表达HIF-1α后显著降低,而在添加YC-1后得到恢复。进一步构建HIF-1α表达载体PcDNA3.1-HIF-1α与BMP7启动子荧光素酶报告载体pGL4.1-BMP7,检测发现HIF-1α转录因子对BMP7启动子活性有明显的抑制作用,从而负性调控BMP7表达。综上所述,本研究揭示了低氧微环境具有提高ADSCs增殖能力、加强ADSCs细胞功能的作用。使用ADSCs条件培养基特别是Hypo-cm可以促进DPCs生长、提高DPCs特异性标志基因的表达。ERK1/2信号通路和HIF-1α共同参与调控了低氧微环境下ADSCs对DPCs生长的促进机制。上述结果对于理解毛囊发育及其再生机理具有重要的理论和现实意义。