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[背景与目的]肝内胆管细胞癌(ICC)分属腺癌,区别于肝门部胆管癌,其来源于二级胆管及其分支的上皮组织。近年来,多项研究提示其细胞表面标志物及其他生物学特征与肝门部胆管癌明显不同。ICC是常见的肝脏原发性恶性肿瘤之一,ICC约占肝脏原发恶性肿瘤的10%-15%。发病率为肝脏原发恶性肿瘤的第2位,近年来其发病率逐年呈上升趋向。ICC早期无明显临床症状,症状隐匿,早期难以发现,多数患者发现时己失去手术时机,因此对ICC的早期诊断和及时治疗提出了更高的要求。B7-H4是最近发现的协同刺激因子B7家族新成员,研究表明,B7-H4在一些肿瘤组织上高表达,并与临床分期和病理分级相关。本课题拟重点研究B7-H4介导ICC细胞恶性转化发展的病理学机制,探讨B7-H4是否直接影响肿瘤细胞的生物学活性,从而进一步阐明B7-H4在ICC病理过程中的作用,为临床ICC靶向治疗提供理论依据及实验基础。[方法]组织层面：1.利用B7-H4抗体通过免疫组化技术分析B7-H4及其可能的通路分子在肝内胆管癌组织中的表达。2.WB法检测癌组织及癌旁组织中的B7-H4表达。细胞层面筛选筛选B7-H4高表达的ICC细胞系……QBC939、RBE转染慢病毒(shRNA-B7-H4)转染ICC细胞系QBC939、RBE,用RT-PCR及WB、细胞免疫荧光法验证B7-H4 mRNA及蛋白的表达情况。细胞功能试验体外细胞实验：1.细胞形态学：显微镜观察转染前后的细胞形态学变化2.细胞功能学改变：2.1：CCK-8法测细胞增殖成长变化；2.2：划痕愈合试验测查细胞迁移能力变化,Transwell法试验检测细胞侵袭能力改变；2.3：WB法检测转染前后的B7-H4及E-cad、Snail、Vimentin、Erk1/2、AKT等)细胞信号分子的改变；2.4：流式细胞术——Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡;2.5：细胞免疫荧光法检测细胞信号分子(如E-cad、Snail、Vimentin、Erkl/2、AKT等)的改变。[结果]1.B7-H4在ICC组织(或细胞系)中的表达显著高于癌旁组织(或细胞系)且其高表达的分度与肿瘤病理分级及淋巴结转移等密切相关。2.设计合成的shRNA-B7-H4三条序列中有两条可显著抑制B7-H4基因的表达。3.体外实验发现：3.1经shRNA介导B7-H4表达沉默后,QBC939、RBE细胞连接紧密、折光性减弱、伪足明显减少。伴上皮表型标记分子E-cad表达上调,间质表型标记分子Vimentin表达下调,提示B7-H4可参与ICC细胞形态改变。3.2 B7-H4转染后的ICC细胞在细胞增殖、划痕迁移及Transwell侵袭能力减弱,凋亡增加。3.3 B7-H4转染后的ICC细胞Caspases 3 (active)、Bax表达上调(凋亡促进因子),Bcl-2表达则下调,其在细胞凋亡过程中主要起抑制作用,并伴有Erkl/2磷酸化程度的下降。[结论]B7-H4在ICC中呈现高表达,与肿瘤分期、病理分级及淋巴转移呈正相关,提示该分子可能参与ICC病理进程。ICC靶向慢病毒抑制(shRNA-B7H4)参与了肝内胆管上皮的间充质转化,即EMT过程。同时也可促使Caspases-3、Bc1-2等的激活,并抑制Bax的表达及Erk1/2的磷酸化,同时促使ICC细胞凋亡。上述结果均提示其在ICC发病中的作用。B7-H4的高表达参与了ICC的病理进程,靶向B7-H4抑制可在一定程度上影响ICC细胞的生物学行为,有望成为ICC新的潜在治疗靶点。