油茶(Camellia olifera)是我国重要的木本油料作物,具有很高的经济价值。进年来随着油茶产业的不断发展,油茶病虫害日趋严重。其中油茶炭疽病(Camellia oleifera anthracnose)是油茶的主要病害之一,严重影响了油茶的产量和质量。然而化学农药的泛滥使用不仅使油茶植株产生了抗药性,同时严重污染了环境。油茶病虫害的绿色生物防治成为当前研究的热点。本实验室筛选出一株对油茶炭疽病有强烈抑制作用的油茶内生拮抗细菌Y13,为了将Y13菌株更好的应用于生产,本论文主要探讨其抑菌机理。以Y13发酵液为研究对象,采用乙醇沉淀法、固相萃取法、高效液相色谱法以及质谱法,对油茶内生菌Y13产生的主要抑菌物质进行分离纯化及结构鉴定。研究主要结果如下:(1)油茶炭疽病内生拮抗细菌Y13抑菌物质分离。采用液体摇瓶发酵法获得Y13发酵液,通过硫酸铵沉淀法和乙醇沉淀法对Y13发酵液进行抑菌物质提取,结果表明乙醇沉淀法获得的提取物的总体抑菌效果高于硫酸铵提取物,因此筛选出乙醇沉淀法为最佳提取方法。通过设置40%、60%、70%、80%、90%,五个乙醇浓度进行抑菌物质分离比较,结果表明80%乙醇提取物所产生的平均抑菌圈直径最大,达到19.50mm,因此确定最佳乙醇提取浓度为80%。(2)油茶炭疽病内生拮抗细菌Y13抑菌物质纯化。首先对80%乙醇提取物进行固相萃取并富集,固相萃取剂选为甲醇,浓度分别设置为0、45%、65%、95%。抑菌结果表明65%甲醇萃取后富集得到的抑菌物质最多。随后将65%甲醇富集后的粗提物经过反相高效液相色谱纯化。色谱图中共出现20个主要的色谱峰,抑菌结果表明其中有16个色谱峰对应的组分有活性。其中保留时间在10.5-26.0min的8个组分产生了抑菌圈,其中保留时间在11.Omin的组分产生的抑菌圈最大;保留时间在27.5-39.5min的8个组分产生了变色圈,其中保留时间在37.5min的组分产生的变色圈最大。通过对色谱条件的反复优化,最终确定色谱柱选用制备型C18(5μm 10×250mm)色谱柱,流动相为乙腈和超纯水(均加有0.1%三氟乙酸),流动相洗脱浓度为44%-94%,流速为0.7mL/min,检测波长为210nm。将各个活性组分分别收集并通过分析型高效液相检测,选用C8(3μm,4.6×250mm)色谱柱,流动相为加有0.1%三氟乙酸的乙腈和超纯水,流速为0.5mL/min,检测波长为210nm。结果表明抑菌活性组分所对应的色谱峰的纯度已经达到了质谱鉴定的要求。(3)油茶炭疽病内生拮抗细菌Y13抑菌物质结构鉴定。采用离子阱质谱对抑菌活性物质分别进行结构鉴定。主要采用一级质谱、二级质谱扫描以及碰撞诱导解离技术和脉冲碰撞能量诱导解离技术两种解离技术相结合,对各个活性组分进行化学结构解析。经鉴定保留时间11.Omin组分为依枯草菌素的同系物,其一级结构式为:Cyclo(C14βAA-Asn-Tyr-Asn-Gln-Pro-Asn-Ser)。保留时间在 11.0-25.0min的抑菌物质均为依枯草菌素同系物(Iturin),种类共达到40种以上。保留时间在37.5min物质为丰原素同系物(Fengycin),其一级结构式分别为R’(C15)-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Val,属于 FengycinA2 和 R’(C14)-Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala-Pro-Gln-Tyr-Ile,属于 FengycinA1。保留时间在 27.5-39.5min的抑菌物质均为丰原素同系物,种类共达到60种以上。最后对无抑菌活性组分也进行了鉴定,结果表明它们均为表面活性素同系物(Surfactin),种类达到30种以上。