论文部分内容阅读
目的:筛选具有高侵袭及高腔内种植潜能的膀胱癌细胞亚系,建立可动态观察的膀胱癌腔内种植动物模型,并对相关因素进行初步研究,为膀胱癌腔内种植的基础及临床研究提供理想的模型及平台。方法:以膀胱癌细胞系EJ穿透人工基底膜能力为依据筛选具有体外高侵袭能力的膀胱癌细胞亚系,并对筛选前后膀胱癌细胞的基本生物学特性进行比较;采用脂质体介导质粒转染的方法将质粒pEGFP-C1导入母、子代膀胱癌细胞中,筛选出稳定高表达EGFP的膀胱癌细胞亚系;将稳定高表达EGFP的膀胱癌细胞灌注裸小鼠膀胱中,成瘤后取肿瘤组织体外再培养,连续多次,建立具有高侵袭高腔内种植潜能且表达EGFP的膀胱癌细胞亚系,并对其基本生物学行为进行鉴定。在此基础上,建立膀胱癌腔内种植的动物模型,运用扫描电子显微镜、整体荧光成像系统、激光扫描共聚焦显微镜及流式细胞仪对人膀胱肿瘤细胞裸小鼠膀胱腔内种植的成瘤过程进行动态观察;通过倒置显微镜观察在除菌尿液中培养的膀胱癌细胞;MTT法对比人膀胱癌细胞EJ、人肝癌细胞HepG2和人血管内皮细胞Ecv304分别在尿液、生理盐水和无血清1640中的存活情况;逐渐增加培养基中尿液的方法,诱导并筛选建立高尿液适应性的膀胱癌细胞;ELESA法检测膀胱粘膜损伤与未损伤时小鼠膀胱CXCL12(SDF-1)含量的变化,裸小鼠体内实验对膀胱粘膜的损伤和炎症与膀胱癌腔内种植的关系进行研究。结果:筛选后获得的体外高侵袭力子代细胞(EJ-m3),经15代以上传代后,细胞形态与母代无明显变化,细胞增殖速度较母代有明显加快(P＜0.05),体外侵袭能力较母系明显提高(P＜0.01),动物体内实验证实高侵袭力的子代细胞较母代细胞成瘤率高;成功获得具有高侵袭力和稳定高表达EGFP的单克隆细胞株(EJ-m3-GFP),该细胞EGFP的表达率为99.9%,增殖指数、生长曲线和体外侵袭力与未转染前相似(P＞0.05);建立了高腔内种植潜能的膀胱癌细胞亚系(EJ-im3-GFP),并且该亚系细胞CXCR4的表达率显著高于膀胱癌细胞EJ(P=0.001);构建出可以通过体视荧光镜和流式细胞仪对肿瘤进行有效评价的膀胱癌细胞膀胱腔内种植的动物模型;观察到人膀胱癌细胞裸鼠腔内种植的过程呈倒抛物线型;EJ细胞在尿中12h贴壁,24h仍可见到存活细胞,经多元方差分析,在尿液中培养相同时间时,EJ较HepG2(P＜0.001)和Ecv304(P=0.014)的存活数目多;HepG2与Ecv304的差异无统计学意义(P=0.062);高尿液适应性的膀胱癌细胞在尿液中,24h时有大量细胞存活,48h仍有细胞存活;胰霉损伤的小鼠膀胱粘膜出现充血水肿和炎症细胞侵润,趋化因子CXCL12(SDF-1)的含量增加;出现膀胱粘膜损伤和炎症的裸小鼠,膀胱腔内种植的发生率更高。结论:膀胱肿瘤细胞的侵袭力,与膀胱癌的腔内种植呈正相关;EGFP转染人膀胱癌细胞EJ及其体外高侵袭力亚系EJ-m3未对其基本生物学特性产生明显影响;CXCR4在膀胱癌细胞中有表达,并且高腔内种植潜能膀胱癌细胞亚系EJ-im3-GFP的表达率显著高于膀胱癌细胞EJ;膀胱癌细胞腔内种植的动物模型成瘤率高,可以在不处死裸鼠的情况下体外、动态观察肿瘤的生长;人膀胱肿瘤细胞裸小鼠膀胱腔内种植的形成过程为倒抛物线型。膀胱肿瘤细胞对尿液具有高适应性,体外培养的膀胱肿瘤细胞可以在尿液中存活一定时间(至少12h);膀胱粘膜损伤后会出现局部炎症反应及趋化因子CXCL12(SDF-1)的高表达;并且膀胱粘膜损伤与膀胱癌腔内种植呈正相关。