垂体是人体最重要的内分泌器官,它由腺垂体和神经垂体组成。腺垂体是人体激素的分泌中心,主要细胞类型包括:生长激素(Gro wth Hormone,GH)细胞、促甲状腺激素(Thyroid Stimulating Hor mone,TSH)细胞、催乳素(Prolactin,PRL)细胞、促性腺激素(G onadotropin,GnH)细胞和促肾上腺皮质激素(Adreno-cortico-tr opic-hormone,ACTH)细胞。垂体发育异常、肿瘤、感染、垂体卒中等各种垂体疾病都可以引起腺垂体激素分泌功能异常,影响人体的正常生长发育。垂体功能低下是最常见的垂体疾病之一,发病率为1/4000到1/10000。目前临床治疗垂体功能低下的方式是激素替代疗法,患者需要接受终身治疗,且治疗效果不稳定、花费大、生活质量改善不理想。近年来,细胞治疗已经在糖尿病、心衰、神经病变等领域取得了很大的进展,细胞疗法有望成为治疗垂体功能低下的新方式。腺垂体中的各种激素分泌细胞和垂体干细胞(pituitary stem cell,PS C)均有可能成为治疗垂体功能低下的种子细胞。但目前关于腺垂体激素分泌细胞和PSC的体外分离培养尚缺乏系统性研究。旋转细胞培养系统(RCCS)是一种可在地球上模拟微重力的三维培养体系。RCCS比二维培养更接近体内环境,又能避免体内实验的伦理问题和在体环境的复杂性,已被广泛用于器官发育、细胞间相互作用、细胞分化等基础研究中。目前尚未应用于腺垂体来源细胞相关研究。目的:本研究将通过探索小鼠腺垂体中不同类型细胞(激素分泌细胞和PSC)的分布情况,分别进行体外分离培养,以阐明腺垂体来源细胞的体外生长特性,并借助拟微重力三维培养体系进一步优化培养条件,为细胞移植治疗垂体功能低下种子细胞及培养体系的选择提供实验依据。方法:1.小鼠脱颈处死,分离垂体组织,石蜡包埋,组织切片,H&E染色观察垂体结构。2.分离腺垂体,使用机械分离和胶原蛋白酶进行消化,得到细胞悬液。3.使用含10%血清的DMEM/F12培养基对垂体细胞进行体外培养,形态学观察并采用ELISA测定各种垂体细胞激素分泌情况。4.拟微重力三维培养体系对垂体细胞进行体外培养,观察细胞生长形态,免疫荧光鉴定细胞类型,ELISA检测激素分泌量。5.采用免疫荧光对干细胞标记物SOX2,垂体细胞标记物FSH,LH,ACTH等进行标记,分析腺垂体中不同类型细胞的分布情况。6.采用酶消化法,用含细胞因子的无血清培养基分离培养PSC,研究PSC的体外成球能力,并通过免疫荧光、QPCR对PSC标志物表达情况进行检测。7.对PSC进行分化培养,免疫荧光和QPCR检测各种激素细胞标志分子的表达情况,并统计其分化比例。8.拟微重力三维培养体系中,PSC培养14天形成微组织,H&E染色观察微组织结构,免疫荧光观察PSC增殖及分化情况。结果:1.垂体组织包含前叶,后叶和中间叶三部分,腺垂体主要由前叶和中间叶组成。SOX2阳性细胞集中存在于腺垂体组织前叶和中间叶的边缘区域,并在前叶散在分布。各种激素分泌细胞散在分布在垂体前叶内,包括ACTH、FSH及LH激素分泌细胞。2.采用机械分离的方法成功分离原代腺垂体细胞并使用传统细胞培养方法进行体外培养,同时优化培养条件,使用RCCS系统对垂体激素分泌细胞进行体外培养,细胞形态较好且能够培养较长时间,激素分泌量较传统培养方法增加。3.从垂体前叶中分离的PSC通过无血清培养能够增殖传代,并成功传至第四代。在培养的前两代PSC标记物SOX2阳性细胞比例可达到97%、85%。激素分泌细胞比例较低,其中ACTH阳性细胞为(14±3)%,FSH阳性细胞为(0.3±0.1)%,LH阳性细胞为(0.6±0.2)%。传至第3代时,激素分泌细胞比例升高,细胞增殖较为缓慢。其中ACTH阳性细胞在(80±8)%,FSH阳性细胞在(1±0.2)%,LH阳性细胞在(2±0.3)%,SOX2阳性细胞比例达到50%。QPCR检测垂体干细胞与激素细胞标志分子在mRNA水平的表达情况,取得与免疫荧光一致的结果。4.PSC采用RCCS进行三维培养可增殖并形成一微组织,形成的微组织中仍有部分细胞为SOX2阳性的PSC,部分PSC分化为GH阳性、ACTH阳性的激素分泌细胞。结论:1.腺垂体组织中存在PSC以及促肾上腺皮质激素细胞、促性腺激素细胞等各种激素分泌细胞。2.从腺垂体组织中成功分离各种激素分泌细胞并进行体外培养传代,激素分泌细胞虽具有分泌功能但增殖能力较差。利用RCCS系统可以提高垂体细胞的体外存活能力并提高其激素分泌量。3.从腺垂体中分离培养的PSC,具有自我更新能力和多向分化潜能,并可在RCCS系统中形成类腺垂体样微组织。综上,本课题通过探索腺垂体细胞和PSC的体外生物学特性,为垂体相关研究奠定理论和实验基础,同时本研究结果还表明RCCS是一种理想的体外细胞培养系统。