目的CYP1B1在某些肿瘤中特异性高表达,而在正常组织中不表达或表达量极低,且CYP1B1的存在会对某些抗肿瘤药物产生影响,降低肿瘤细胞对特定抗肿瘤药物的敏感性,因此,本课题的研究目标是探讨CYP1B1的表达对肿瘤抗药性的影响,克隆构建稳定表达CYP1B1的真核表达载体,以期建立不同肿瘤细胞的药物筛选平台,利用CYP1B1对抗肿瘤药物的影响,指导临床用药,同时研制肿瘤组织CYP1B1表达的免疫组化检测试剂盒,并初步应用于乳腺癌组织CYP1B1表达的检测,为肿瘤的诊断和治疗提供新的指标和依据。方法1、TCDD诱导MCF-7表达CYP1B1后对紫杉醇细胞毒效应的影响采用4个不同浓度的TCDD;溶液(1、2、4、8nmol/L)诱导MCF-7细胞,利用RT-PCR技术测定诱导后CYP1B1mRNA水平的表达情况,采用蛋白印迹及细胞免疫组化技术测定诱导后CYP1B1蛋白水平的表达情况。根据CYP1B1的表达结果,选择8nmol/L的TCDD溶液诱导MCF-7细胞表达出高水平的CYP1B1,分别用含有6种终浓度的紫杉醇溶液(0、0.001、0.01、0.1、10、30μg/ml)作用于有CYP1B1表达的MCF-7细胞,采用MTS比色法测定紫杉醇对MCF-7的细胞毒作用,判断CYP1B1是否可导致紫杉醇细胞毒效应的下降。2、CYP1B1的克隆及真核表达载体的构建利用RT-PCR技术从MCF-7细胞中克隆CYP1B1基因,采用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ酶双酶切、T4DNA酶连接的方式,将CYP1B1基因与真核表达载体pIRES2-EGFP连接,并用EcoR Ⅰ酶切和DNA测序的方式对连接产物进行鉴定,构建CYP1B1真核重组表达载体pIRES2-EGFP-CYP1B1。3、CYP1B1免疫组化诊断试剂的研制及乳腺癌组织的初步应用选择并合成CYP1B1特异性肽段,以此为免疫原对家兔进行免疫,获得抗CYPIBI的特异性抗体,将免疫血清纯化后采用ELISA法对其抗体效价进行测定。将成功制备的兔抗CYPIBI抗体作为一抗,经过对免疫组化条件的筛选与优化,建立起免疫组化检测肿瘤组织CYP1B1表达的方法,并初步应用于乳腺癌组织标本的检测。结果1、TCDD诱导MCF-7表达CYPIBI后对紫杉醇细胞毒效应的影响结果不同浓度的TCDD(1、2、4、8nmol/L)作用于MCF-7后,CYP1B1mRNA的相对含量与对照组相比均增强,且随着TCDD浓度的增加,CYP1B1mRNA的表达量也相应增加。在对CYP1B1蛋白表达水平的检测中可以得知,TCDD诱导后,细胞中CYP1B1的蛋白表达水平与mRNA的表达情况一致,即随着TCDD浓度的增加,CYP1B1的蛋白表达量也相应增加。将不同浓度的紫杉醇作用于经过TCDD诱导的MCF-7细胞后,对MCF-7细胞的生长抑制率与其作用于未经TCDD诱导的MCF-7细胞相比均有所下降,当紫杉醇浓度在0.01-O.1μg/ml时,两组之间的差别更加明显,说明在紫杉醇的有效治疗浓度范围内,CYPIBI的存在降低了紫杉醇的细胞毒作用。2、真核表达载体pIRES2-EGFP-CYP1B1的构建本实验成功克隆出了CYP1B1目的基因,构建了CYP1B1真核表达载体,可以将重组子转染至肿瘤细胞,使CYP1B1稳定表达,进一步研究CYP1B1与抗肿瘤药物的关系,建立不同肿瘤细胞的药物筛选平台,通过CYP1B1对抗肿瘤药物的影响指导肿瘤患者的个性化治疗。3、CYPIBI免疫组化检测方法的建立与乳腺癌组织的初步应用成功制备了抗CYP1B1的免疫血清,经过测定,其抗体效价达到1：128。经过多次重复实验的筛选,确定了免疫组化中的若干重要条件,建立了检测肿瘤组织CYP1B1表达的免疫组化方法,将其初步应用于乳腺癌组织的检测后,成功的在乳腺癌组织中检测出了CYP1B1的表达,初步验证了CYP1B1在肿瘤组织中特异性表达这一研究结果,为肿瘤的诊断与药物治疗提供了参考与依据。结论1、TCDD能够诱导MCF-7细胞表达CYPIB1,且在一定浓度范围内,CYPIB1的表达水平随着TCDD浓度的升高而增加；MCF-7细胞表达CYPIB1后能够抑制紫杉醇的细胞毒作用。2、成功克隆并构建了CYPIB1的真核表达载体pIRES2-EGFP-CYP1B1,为进一步研究CYPIB1的功能及其与抗肿瘤药物的关系奠定了基础。3、成功制备了抗CYPIB1的特异性血清,建立了免疫组化检测肿瘤组织CYPIB1表达的方法,通过对乳腺癌组织的初步应用证实其能够应用于肿瘤组织中CYPIB1表达的检测,为肿瘤的诊断与治疗提供了新的指标与依据。