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猪圆环病毒3型（PCV3）自2016年在美国首次报道以来,世界上主要养猪国家都发现了这种新型病毒。患病猪主要表现繁殖障碍、皮炎与肾病综合征、心肌炎与多系统炎症等症。无明显临床症状的猪体内也能检测到PCV3。PCV3基因组大小为2000bp,有3个开放阅读框（ORF）,其中orf1编码复制酶（Rep）,orf2编码核衣壳蛋白（Cap）,orf3的起始位置和功能未知。除家猪外,在野猪、狗、牛、小鼠以及蜱体内都能检测到PCV3。目前,关于PCV3的研究主要集中在流行病毒学调查和检测方法,PCV3流行毒株的分离和重组病毒的拯救鲜有报道,致病机制也不甚清楚。自噬是真核细胞内高度保守的营养物质“回收”过程,在维持细胞稳态、预防因营养代谢或感染引起的应激方面发挥着重要作用。目前还没有PCV3与自噬相关的研究报道。本研究旨在:（1）建立检测PCV3的TaqmanqPCR和间接ELISA方法,进行浙江地区PCV3的流行病学调查,并明确PCV3流行毒株的orf2基因的序列特征;（2）尝试在猪源细胞PK-15和IPEC-J2以及BALB/c小鼠体内进行PCV3重组病毒的拯救,为研究PCV3的致病机制奠定基础;（3）探究PCV3 Cap蛋白是否诱导细胞自噬,如果诱导,是否通过mTOR信号通路发挥作用。1.浙江地区猪圆环病毒3型的流行病学调查我们建立了 Taqman qPCR检测方法,对2014-2017年采集的283份临床样品进行检测,PCV3总阳性率为67.1%,其中只感染PCV3的样品仅占三分之一,大多数是混合感染,主要是PCV3与PEDV共感染（41.6%）,PCV3与其他病毒共感染比例较低。以PCV3 Cap原核截短蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法,对2011-2017年采集的2345份猪血清样品进行检测,总阳性率为52.6%。随机选择203份猪血清进行病毒核酸检测,qPCR比ELISA的阳性率更高（81.3%vs 56.2%）。基于200株PCV3 orf2基因的系统发育分析,PCV3可以分为三个主要的基因型,即PCV3a、PCV3b和PCV3c,本研究测序获得的38株PCV3 orf2主要集中在PCV3c基因型。通过对PCV3三种基因型的Cap蛋白关键氨基酸位点（24、27、77和150位）分析,只有PCV3a基因型的序列显示明显的“VKSI”氨基酸特征（约占95%）,其余两种基因型没有明显的特征性氨基酸。本研究证明了 PCV3在浙江的流行率较高;可能2014年之前就在浙江省出现,推测很可能是在2012年,因为这一年的PCV3血清阳性率很高。2.猪圆环病毒3型重组病毒拯救方法的探索通过PCR和体外环化方式获得PCV3环状DNA,将其转染猪源细胞PK-15和IPEC-J2,盲传10代,经qPCR检测,细胞和上清中的PCV3 DNA呈下降的趋势,第10代时已接近qPCR检测下限（102拷贝数）;传代过程中的IFA检测,未见PCV3特异性荧光细胞。而作为阳性对照的PCV2,第1代时重组病毒就能拯救成功。将PCV3环状DNA通过尾静脉注射的方式接种BALB/c小鼠,14 d和21d后,血清中未检测到PCV3抗体,血清、脾脏和肝脏中的PCV3 DNA载量持平或略有下降。我们试图用不同的载体和病毒序列进行拯救:将参考毒株PCV3/MO2015 和 PCV3/Hebei-LY-2015 的全基因组序列分别克隆于 pBlueScript SK（+）质粒,构建重组质粒pSK-PCV3,分别转染PK-15细胞,盲传5代,上清和细胞中的PCV3 DNA含量呈下降的趋势,第5代时已接近qPCR的检测下限;经qPCR检测,PCV3 orf2基因没有转录。综上,在猪源细胞PK-15和IPEC-J2以及小鼠体内拯救PCV3重组病毒不成功。3.猪圆环病毒3型核衣壳蛋白诱导细胞自噬受限于没有活病毒进行致病性研究,我们构建了携带PC V3 orf2基因的重组质粒pCMV-Cap和重组慢病毒LV-Cap,不论是质粒转染或是慢病毒介导的基因转导,PCV3 Cap蛋白在猪源细胞PK-15和IPEC-J2上低表达甚至不表达。鉴于HEK293T细胞转染效率高,我们探究了 PCV3 Cap蛋白对HEK293T细胞的作用。通过免疫印迹、激光扫描共聚焦显微镜和透射电镜观察,我们首次证明PCV3 Cap蛋白能够诱导HEK293T细胞发生自噬,并且能够诱导完整的自噬流。此外,泛素-蛋白酶体途径也参与PCV3 Cap蛋白诱导的自噬过程。进一步研究表明,PCV3 Cap蛋白可能是通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）磷酸化,从而诱导细胞发生自噬。综上所述,利用建立的PCV3核酸qPCR检测方法和血清抗体间接ELISA检测技术,发现浙江地区猪场的PCV3阳性率较高;PCV3 Cap蛋白通过抑制mTOR磷酸化,进而诱导细胞发生自噬,泛素-蛋白酶体途径也参与这一过程。研究结果为进一步开展PCV3防控及其致病机制研究提供借鉴。