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目的和意义中枢神经系统是白血病髓外浸润的常见部位,发生中枢神经系统白血病(central nervous system leukemia, CNSL)的患者总体生存时间短,预后差,然而目前对CNSL的发病机制却知之甚少。白血病细胞存在于造血系统中,随血液循环到达全身各部位,同实体瘤的转移过程相似,其在转移过程中必须克服某些生理屏障。血脑屏障(Blood-brain barrier, BBB)是位于血液和脑组织之间的一个选择性通透的细胞系统,严格控制血脑两侧的物质转运。研究表明基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP) -2和MMP-9与白血病细胞的侵袭能力有关,在某些中枢神经系统疾病中,MMP-2和MMP-9能够通过破坏BBB的脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMVECs)之间的紧密连接而增加BBB的通透性。已知某些白血病细胞高表达MMP-2和MMP-9,且其表达高低与其预后密切相关,但在白血病细胞浸润中枢神经系统过程中是否能通过分泌的MMP-2和MMP-9作用于BBB并增加其通透性,从而获得其对中枢神经系统的侵犯目前尚不清楚。本课题通过建立体外BBB模型和CNSL动物模型,研究CNSL中白血病细胞分泌的MMP-2和MMP-9对BMVECs紧密连接和BBB的影响,探索CNSL的发病机制。方法第一部分实时定量PCR检测SHI-1、HL-60和U937白血病细胞MMP-2、MMP-9 mRNA表达水平;明胶酶谱法检测SHI-1、HL-60和U937白血病细胞培养上清中MMP-2和MMP-9的表达;体外穿膜实验观察各白血病细胞的体外侵袭能力。观察MMP抑制剂GM6001对各白血病细胞分泌MMP-2和MMP-9的变化及对白血病细胞侵袭能力的影响。用RNA干扰技术沉默SHI-1细胞MMP-2和MMP-9基因的表达,并观察沉默MMP-2和MMP-9后对SHI-1细胞分泌MMP-2和MMP-9的影响及对SHI-1细胞侵袭能力的影响。将原代人BMVECs接种于Transwell小室系统中建立体外BBB模型并鉴定,将GM6001处理后的HL-60、SHI-1和U937细胞或小干扰RNA (iRNA)沉默MMP-2或MMP-9后的SHI-1细胞于BBB模型中与BMVECs共培养24 h,倒置相差显微镜观察共培养后BMVECs的形态变化;激光共聚焦显微镜观察BMVECs的紧密连接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin的表达变化;计算白血病细胞的穿膜率或侵袭率反映白血病细胞对BBB通透性的影响。第二部分对44只BALB/c裸鼠进行切脾,环磷酰胺腹腔注射及全身亚致死剂量辐照等预处理后,将其随机分为3组,空白对照组:共8只,经尾静脉注射0.2ml PBS;SHI-1组:共30只,尾静脉接种1.2×107个SHI-1细胞;GM6001组:共8只,尾静脉接种1.2×107个SHI-1细胞后从d1天开始予5mg/kg/d GM6001腹腔注射,直至21天。观察各组裸鼠的饮食、活动性、体重等一般情况的变化及瘫痪、失明等CNSL的临床表现,同时每周处死2只SHI-1组裸鼠和1只空白对照组裸鼠观察最早能检测到人MLL/AF6融合基因的最早时间。所有裸鼠在层流柜中无菌饲养观察至接种SHI-1细胞后第60天。在裸鼠濒死时将其处死,取脑组织、骨髓及其他各脏器,应用RT-PCR检测各脏器中人MLL/AF6基因的转录,骨髓涂片、组织病理学等方法检测裸鼠脑组织、骨髓及其他各脏器中SHI-1细胞浸润生长情况。应用RT-PCR检测脑组织中人MMP-2和MMP-9基因的转录;原位明胶酶谱法检测脑组织中MMP-2和MMP-9的表达;采用免疫荧光染色激光扫描共聚焦显微镜及Western Blot方法检测BMVECs紧密连接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin的表达,组织免疫荧光双染法检测BBB的破坏情况。结果第一部分①在SHI-1、U937和HL-60白血病细胞中,SHI-1表达较高转录水平的MMP-2和MMP-9及酶活性,且侵袭能力强于其它细胞系(P<0.01)。②与白血病细胞HL-60、SHI-1和U937共培养24 h后,致密融合的BMVECs之间出现间隙,细胞呈单个生长;紧密连接蛋白ZO-1、claudin-5和occludin的表达明显下调;各白血病细胞均不同程度的穿过体外BBB屏障,其中细胞系SHI-1对BMVECs的形态改变及对三种紧密连接蛋白的下调最为明显,对BBB的破坏最强(P<0.01)。GM6001明显抑制了各白血病细胞分泌的MMP-2和MMP-9,使BMVECs的形态有所恢复;同时上调了ZO-1、claudin-5和occludin的表达,降低了BBB的通透性。③用siRNA分别沉默SHI-1细胞的MMP-2和MMP-9基因后,SHI-1细胞分泌的MMP-2和MMP-9明显减少,且细胞的侵袭能力较干扰前明显下降;SHI-1细胞对BBB的破坏程度较前明显降低,同时ZO-1、claudin-5和occludin的表达较MMP-2和MMP-9基因沉默前明显上调。第二部分对照组裸鼠(除外每周处死的)生存期大于60天以上而无死亡。存活的20只SHI-1组裸鼠中有11只在(32.55±0.65) d出现面瘫、肢体瘫痪、失明而不能饮水进食等CNSL症状,大体解剖可见部分CNSL裸鼠除脑组织浸润外同时合并胃、肝脏、膀胱等器官的浸润。脑、骨髓及其它各浸润脏器均检测到人MLL/AF6融合基因的转录,骨髓细胞学涂片可见大量原始细胞。病理组织学检查可见脑实质及软脑膜等脑组织有大量白血病细胞浸润。而GM6001组小鼠无瘫痪、失明等CNSL症状,骨髓细胞学及病理组织学检查无脑组织及骨髓的白血病细胞浸润,其它受浸润的胃、肝脏等脏器的浸润程度较SHI-1组明显减轻,平均存活时间为(41.50±1.62) d,较SHI-1组明显延长(P<0.05)。每周处死的裸鼠中最早于21天在脑组织中检测到人MMP-2和MMP-9基因的转录,11只瘫痪裸鼠发病后脑组织中均检测到人MMP-2和MMP-9基因的转录;原位明胶酶谱显示脑组织浸润部位MMP-2和MMP-9的活性较对照组及未发生CNSL的裸鼠明显增强,同时在白血病细胞浸润部位脑组织BMVECs的紧密连接蛋白claudin-5、occludin和ZO-1表达明显减少,并伴有BBB有不同程度的破坏。而GM6001组脑组织中未检测到人MMP-2和MMP-9基因的转录,claudin-5、occludin和ZO-1的表达较空白对照组无明显变化。结论(1) SHI-1、HL-60和U937白血病细胞均表达MMP-2和MMP-9,且其表达MMP-2和MMP-9的高低与其侵袭能力呈正相关。(2)白血病细胞在中枢神经系统浸润过程中伴有BMVECs紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5、occludin的下调。(3)在CNSL中BMVECs紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5、occludin的下调导致BBB通透性的增加。(4)白血病细胞对BBB的破坏程度与其表达MMP-2和MMP-9的高低呈正相关。(5)白血病细胞在中枢神经系统浸润过程中通过分泌MMP-2和MMP-9介导紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5、occludin的下调而增加BBB的通透性。综上所述,本研究发现白血病细胞表达MMP-2和MMP-9的高低与其侵袭能力呈正相关;通过建立体外BBB模型和CNSL动物模型,我们发现白血病细胞在中枢神经系统浸润过程中伴有BBB的破坏,其中白血病细胞分泌的MMP-2和MMP-9在此过程中发挥了重要作用,MMP-2和MMP-9通过破坏BMVECs的三个关键紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-5、occludin而增加了BBB的通透性,而这些改变可以被蛋白酶抑制剂GM6001和沉默MMP-2和MMP-9基因的表达而改善,从而更加明确了白血病细胞分泌的MMP-2和MMP-9在CNSL发病机制中扮演的角色。