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目的:应用基因沉默技术手段,观察下调PSMB5对NSCs增殖潜能的影响,揭示年龄依赖性NSCs增殖能力降低的机制,以期为神经退行性疾病的治疗提供新思路。方法:1.体外分离培养胚胎(E14)、新生(P0)、幼年(P30)、成年(P90)和老年(P540)小鼠SVZ NSCs,观察其神经球形成周期和神经球形成率。2.分别提取不同年龄阶段(E14、P0、P30、P90、P540)Balb/c小鼠SVZ组织蛋白,通过Western Blot分析其PSMB5蛋白的表达水平差异。3.设计合成PSMB5-si RNA,电穿孔法转染NSCs,电转后48h提取细胞总RNA,72h提取细胞全蛋白,RT-PCR及Western Blot分别从转录水平和蛋白水平测定PSMB5沉默效率,荧光分光光度法检测蛋白酶体活性。4.测量神经球平均直径和数量,并应用Brd U掺入实验分析PSMB5基因沉默对NSCs增殖能力的影响,5.Western Blot检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1及CDK4的表达变化。结果:1.分离培养的不同年龄阶段小鼠NSCs,其中与E14或P0相比,P30、P90及P540小鼠NSCs形成神经球的周期较长,神经球形成率较低,提示NSCs增殖能力呈年龄依赖性下降趋势;同时,Western Blot检测各年龄组SVZ组织蛋白显示PSMB5的表达水平随年龄增高也呈递减趋势,提示PSMB5可能参与NSCs增殖能力的调控。2.Real-time PCR定量分析法和Western Blot半定量分析法分别检测si RNA组和对照组PSMB5 m RNA及PSMB5蛋白的表达变化,结果显示si RNA组PSMB5m RNA和蛋白表达水平较对照组分别降低61.23±1.62%和40.11±2.45%(P<0.05),且蛋白酶体活性较对照组降低24.36±0.14%(P<0.01),提示PSMB5-si RNA电转染NSCs能够抑制其PSMB5的表达,并下调蛋白酶体活性。3.si RNA组神经球平均直径和数量均较对照组显著降低(P<0.05);Brd U掺入实验结果显示si RNA组Brd U阳性率21.58±3.29%较对照组53.47±7.36%显著下降(P<0.05),提示PSMB5基因沉默能抑制NSCs增殖能力。4.应用Western Blot半定量分析转染后细胞周期相关蛋白的表达水平,结果显示si RNA组细胞周期依赖性蛋白Cyclin-D1及其激酶CDK4的表达水平分别较对照组下降46.82±3.14%和32.86±2.75%(P<0.05),提示PSMB5基因沉默可能通过下调细胞周期依赖性蛋白Cyclin D1及其激酶CDK4的表达水平,从而影响NSCs增殖潜能。结论:1.PSMB5可能参与NSCs增殖潜能的调控。2.PSMB5基因沉默能够通过降低蛋白酶体活性,下调细胞周期依赖性蛋白Cyclin-D1及其激酶CDK4的表达,从而抑制NSCs增殖潜能。