目的:肺癌是世界上最常见的癌症之一,其治疗效果在所有肿瘤类型中最差,5年生存率为10%～20%。因肺癌的生存率受到诊断阶段的影响,从早期5年生存率为92%到晚期0%,所以肺癌的死亡率在所有肿瘤中居于首位,新发病率居于第二位,因此,亟待开发、寻找新的治疗肺癌的药物。肺癌可以通过多条通路引起肺癌细胞的增殖迁移,而细胞凋亡是控制肺癌细胞增殖生长的一种重要的细胞内生理活动,在肺癌的发生发展过程中起着重要的作用。近年来,传统中医药在抗癌药物研发领域取得了一系列成果,成为肿瘤治疗的热点。通关藤又名乌骨藤、通光散,为萝藦科牛奶菜属植物通关藤Marsdenia tenacissima(Roxb.)Wightet Arn.的干燥藤茎,其化学成分包括C21甾体皂苷、多糖、黄酮、生物碱和树脂等,广泛用于肺癌的治疗,疗效良好,毒副作用轻微,具有极大的开发利用价值。为了更好的开发和利用通关藤,基于前期相关研究,本实验首先通过网络药理学对通关藤的成分、潜在的肺癌靶点以及相关通路进行研究,明确通关藤抑制肺癌可能的作用机制;从细胞和动物层面进一步验证通关藤作用于肺癌的机制,明确通关藤促进肺癌凋亡的作用以及作用机制。方法:(1)采用网络药理学的方法,通过PubMed和CNKI数据库获得通关藤成分,进行类药性和药代动力学分析,利用SwissTargetPrediction、BATMAN-TCM 和 PharmMapper 预测潜在靶点,与OMIM、TTD、DiGSeE三个疾病靶点数据库进行比对,获得通关藤治疗肺癌的作用靶点,进一步采用Metascape数据库平台对作用靶点的GO注释和KEGG通路进行富集分析和蛋白功能归属。(2)通过查阅文献并结合实验室的前期研究基础确定A549细胞和LLC细胞为体外验证通关藤抑制肺癌研究的载体。用梯度浓度的通关藤5个不同提取部位、消癌平注射液作用于A549和LLC细胞,运用CCK-8法检测药物对细胞的生长抑制作用及其时间依赖性;采用平板集落形成实验和细胞染色进一步观察通关藤是否促凋亡;采用流式细胞仪检测通关藤对A549和LLC细胞凋亡情况的影响。(3)选取造模成功的荷瘤小鼠,随机分为7组:模型组、总提物组、石油醚组、乙酸乙酯组、消癌平组、司美替尼组和顺铂组,每组12只。另设空白对照组(无荷瘤),分别给药干预14天,常规方法剥取肿瘤组织,称重,拍照;采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察小鼠肿瘤组织的病理形态;采用TUNEL法检测肺癌肿瘤组织细胞的凋亡情况,并于显微镜下计数凋亡细胞数,计算凋亡率;结合Western blot法检测小鼠肿瘤组织中Calmodulin,CaMKII,p-CaMKII,MEK1/2,p-MEK1/2,ERK 和 p-ERK 蛋白的表达情况。结果:(1)网络药理学的结果显示通关藤中6个活性成分、27个作用靶点与肺癌治疗相关。(2)通关藤的石油醚和乙酸乙酯部分对肺癌细胞的抑制作用优于其他提取部位,其对LLC细胞的IC50值分别为0.35±0.04 mg/mL、0.29±0.02 mg/mL、对 A549 细胞的 IC50 值分别为 0.56±0.05 mg/mL、0.85±0.04mg/mL,且抑制率呈浓度和时间依赖性。与正常对照组相比,给药组A549和LLC细胞出现典型的凋亡形态学改变,流式细胞术结果显示细胞凋亡率明显升高,同时,细胞内钙离子浓度升高。(3)通关藤给药组小鼠体重与模型组比较均升高,差异具有显著意义(P<0.05);TUNEL法发现通关藤各给药组明显增加肿瘤组织中细胞凋亡率;HE染色结果显示肺癌组织呈现高度异质性,分化程度低,恶性程度高;Western blot法检测结果显示,与模型组比较,通关藤给药组的 Calmodulin,CaMKII,p-CaMKII,p-MEK1/2,p-ERK 蛋白表达水平降低,且与细胞层面细胞内钙离子浓度的改变一致。结论:(1)通关藤治疗肺癌是通过通关藤中多种有效成分与多个靶点相互作用,通过PI3K-Akt/Ca2+/MAPK信号通路发挥作用。(2)通关藤于体内和体外均可诱导细胞凋亡,其非极性部分效果更显著,提高细胞内钙离子浓度,减少钙调蛋白表达导致CaMKII,p-CaMKII,p-MEK1/2和p-ERK蛋白下调激活凋亡级联反应。