【摘 要】
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome,PRRS）是一种高度传染性疾病,由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus,PRRSV）引起,该病对全球生猪养殖产业带来了巨大的经济损失,随着病毒抗原的变异和新型PRRSV受体的不断发现,该病的致病机制
【基金项目】
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科技部十三五国家重点研发计划（编号:2017YFD0501004）; 国家自然科学基金面上项目（编号:31672534）
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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome,PRRS）是一种高度传染性疾病,由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Respiratory and Reproductive Syndrome Virus,PRRSV）引起,该病对全球生猪养殖产业带来了巨大的经济损失,随着病毒抗原的变异和新型PRRSV受体的不断发现,该病的致病机制越来越复杂。唾液酸黏附素（CD169）是PRRSV的主要细胞受体之一,现有研究认为CD169在介导PRRSV吸附和内化进入巨噬细胞过程中起着重要作用,但CD169基因敲除的猪对PRRSV仍然易感,所以对于CD169在PRRSV感染中发挥的作用暂时没有统一定论,因此进一步探究CD169在PRRSV感染易感细胞中发挥的作用机制将有利于加深对CD169受体以及PRRSV致病机理的了解。本课题通过制备识别CD169分子的单克隆抗体以及构建CD169稳定细胞系,探究CD169在PRRSV感染中的作用。研究的主要工作和结果如下:1.猪CD169截短体蛋白表达及其单克隆抗体的制备利用原核表达系统成功表达纯化了CD169截短体蛋白CD169-N540,将该蛋白免疫小鼠,利用细胞融合成功制备了一株可以识别猪内源性CD169分子的单克隆抗体,抗体重链亚型为Ig G1,该单克隆抗体可以识别PAMs细胞膜表面的CD169分子,可用于后续研究。2.猪CD169稳定表达细胞系的构建及CD169在PRRSV感染易感细胞时发挥的作用通过慢病毒包装系统向猪肺泡巨噬永生化细胞系CRL-2843和CRL-2843CD163导入CD169成功构建了CRL-2843CD169和CRL-2843CD163/CD169细胞系,CRL-2843CD163/CD169细胞系对PRRSV的感染增殖效率接近PAMs细胞,可用于PRRSV体外复制机制的研究;CD169不是PRRSV感染的决定性受体,而是PRRSV感染的协同受体,CD169的导入极大的提高了CRL-2843CD163细胞对PRRSV的易感性;使用m Ab-CD169封闭CD169阳性PRRSV易感细胞(CRL-2843CD163/CD169,原代PAMs)上的CD169分子可以抑制PRRSV感染,表明CD169在促进PRRSV感染中发挥重要作用;CD169分子的表达不影响细胞吸附病毒的能力,但促进了病毒内吞进入宿主细胞的过程。3.猪CD169参与PRRSV入侵易感细胞的机制及病毒配体筛选PRRSV-N蛋白可以结合PAMs膜表面CD169,中和试验结果表明针对PRRSV-N蛋白的特异性抗体在PAMs和CRL-2843CD163/CD169细胞中可以中和病毒,且只有在靶细胞上存在CD169时才可抑制PRRSV感染;双抗夹心ELISA和病毒捕获实验以及对PRRSV的密度梯度离心可以从PRRSV感染的细胞培养上清中检测到由病毒核衣壳蛋白和病毒核酸组成的核衣壳,核衣壳形式的病毒颗粒可能与CD169介导的PRRSV对靶细胞的感染密切相关。综上所述,本研究成功制备了一株能够特异性识别猪内源性CD169分子的单克隆抗体（m Ab-CD169）;CD169在协同促进PRRSV感染中发挥重要作用,CD169的导入可以增加细胞对PRRSV的易感性,CD169促进细胞对PRRSV易感性的增加是通过促进PRRSV内吞进入宿主细胞的过程实现的;PRRSV-N蛋白可以结合CD169,在CD169分子存在时,针对PRRSV-N蛋白的特异性抗体具有中和活性。
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