目前，越来越多的难降解化合物如类固醇类物质、多环芳烃(PAHs)、杀虫剂、苯酚、氯乙烯等大量排入环境中，对生态造成了重大的破坏，也对人体健康产生了很大的影响。类固醇(如雌二醇、口服避孕药等)又称为甾体化合物，是已经被确认为具有雌激素活性的70种化学物之一。环境激素，具有类似雌激素的作用，主要随人类的活动排放到环境中，破坏机体稳定性和调控作用，成为继“臭氧层破坏”、“温室效应”之后又一全球性的重大环境问题。环境中的天然雌激素和人工合成雌激素主要是由家畜和人类排泄而进入环境的。近年来，由于饲养业的迅猛发展，在饲养家畜排泄大量天然雌激素的同时，为促进动物生长过多使用人工合成雌激素，使雌激素污染问题变得更加严重。同样，随着人口增加、城市化进程的加快以及人类大量使用避孕药等激素类药物，使人类自身也成为环境雌激素污染的重要因素。 对于这些难降解污染物的治理常使用物理法、化学法和生物修复法等。但由于土著微生物及常规的微生物驯化方法降解效率低，时间长，而构建高效的基因工程菌可以显著提高污染物的降解效率，利用基因工程方法改造野生型菌株并对其功效进行研究，筛选高效的基因工程菌株并将其应用到实际的生物修复中是目前对这些难降解物质进行治理的有效途径． 目前已有研究报道睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)能够降解类固醇类物质，所以本试验在温度适应性、酶活力、对胆固醇的降解率等方面从睾丸酮丛毛单胞菌野生型菌株及其四个经过基因改造的工程菌株中筛选出了高效基因工程菌株Cp7、Ca3，同时对鸡粪和塘底污泥中的甾体化合物含量进行调查研究，将Cp7、Ca3应用到播施鸡粪的田地及塘底污泥中进行初步的生物修复应用，进一步检验了工程菌株的降解力。主要研究结果如下： 一、在本试验设置的六个不同温度下，四个基因工程菌株的活菌数比Ct平均高出27％，达到极显著差异，说明工程菌株经过基因改造后的温度适应性比野生型明显增强，特别是Cp4活菌数最高，其次是Ca3，Cp7。Commamonas testosteroni工程菌株在较低温条件下可以生存_个月以上，但在较高温度如40℃时则只能生存几天或更短时间，不能很好地对污染物进行降解。所以，这几个工程菌株可以在我国大部分地区施用，特别是在北方中低温地区。利用Commamonastestosteroni工程菌进行生物修复的温度以30℃为最佳，此时工程菌株生存能力、繁殖能力最强。 二、3α-HSD酶活力测定得出，酶活力大小依次为：Cp7)Cp4)Ca3>Cb7>Ct，四个基因工程菌株的酶活力均大于野生型菌株Ct并达到显著差异，Cp7、Ca3、Cp4与野生型菌株之间差异均达到极显著水平，其中Cp7酶活力最高，与其他四个菌株达到显著差异，比Ct高出近50％。这说明，经过基因改造加入强的tac启动子后，工程菌株3α-HSD的酶活力均有了明显提高：而经过点突变后的菌株Cp7、Cp4也表现了强的酶活力，特别是Cp7，点突变后酶活力显著提高，与已经较为稳定且降解活力高的菌株Ca3也达到了显著差异。三、HPLC法测定胆固醇浓度变化(色谱条件：色谱柱：C18柱检测器：waters2996二极管阵列检测器流动相：100％甲醇柱温：30℃流速：1ml/min)测定工程菌对胆固醇的降解能力，结果表明，工程菌能够以胆固醇为唯一碳源和能源，有效地对胆固醇进行降解；在不同浓度的胆固醇培养基中，工程菌株Ca3，Cp4，Cp7逆境下的生存能力不如野生型菌株Ct，活菌数不如Ct多，但由于对其关键酶基因进行了有效的改造，其降解能力均明显高于Ct，Ca3平均降解率为78.68％，比野生型的降解率高出11.3％，其次为Cp7、Cp4。 四、在工程菌降解鸡粪的试验中，菌株Ca3的平均降解率达到了27.1％，比Ct(22.8％)提高了4.3％；在上，工程菌株经过一段时间适应土著微生物，在20d时降解率达到最大值23.5％。 五、通过试验得出，在饲养大鱼的塘底污泥和未经处理的生活污水沟的污泥中存在甾体化合物，含量在1.5mg/g左右，随时间变化幅度不大：在污泥中同时检测出睾丸酮丛毛单胞菌野生型菌株，表明在自然环境下包括睾丸酮丛毛单胞菌野生型菌株在内的土著微生物不能有效降解污泥中的甾体化合物。在添加工程菌后，工程菌株Cp7、Ca3的降解率均与野生菌株达到了极显著差异，Cp7的降解率达到了34.4％，是Ct的1.97倍，Ca3的降解率达到了31.4％，是Ct的1.79倍。 六、初步建立了从鸡粪及污泥中快速提取、大量测定甾体化合物的方法。具体步骤为：田间取样→烘干→研钵磨碎→(过40目筛)一准确称取样品5.0g→加入2mol/l硫酸30ml，超声波酸化2h→过滤，收集滤渣并烘干→将烘干的滤渣包成滤纸包，加入到圆底烧瓶中→加入50ml氯仿→超声波提取1h→如有需要，过滤收集滤液→吸取样品3ml，加入硫酸→乙酸酐显色剂2ml→混匀，50℃恒温水浴显色40min→取出，冷至室温，分光光度计测定OD<,460>。 以上研究结果对了解C. testosternoi基因工程菌的基本特性提供了理论基础，为进一步将该工程菌应用到实际的生物修复中，治理环境中的甾体化合物污染奠定了基础。