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本文分析了计算机模拟基因操作的结果,选出影响大肠杆菌琥珀酸产量的关键酶延胡索酸还原酶FRD,研究了其大肠杆菌中对大肠杆菌琥珀酸合成的影响,通过扩增frd基因,与分支途径的酶的敲除相结合,以及添加延胡索酸底物等三种方法,增大了延胡索酸转化为琥珀酸这一代谢途径上的通量,从而提高了琥珀酸的产量。得到的主要结果如下:
从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 168中克隆出编码延胡索酸脱氢酶的sdh片断,整合到质粒载体pTrc99A上,构建表达异源frd基因的质粒pTSXT,在大肠杆菌野生型W1485中表达,琥珀酸的产量得到一定提高,副产物的产量有不同程度的下降。
将pTSXT质粒在缺失adhE基因的菌株(TUQ5)中表达,琥珀酸的产量的提高幅度更大。
向培养基中添加低浓度的延胡索酸为底物,延胡索酸不同程度的被含有重组质粒的菌株转化为琥珀酸。
分析实验结果与模拟结果的差异,认为其是可能由FRD基因的复杂亚基结构以及大肠杆菌代谢网络的复杂性造成的。