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CUEDC2(CUE domain containing 2)是一个含有CUE结构域的保守蛋白质。CUE结构域是一个大约含有40个氨基酸的保守序列,,它不但能够识别细胞内的单泛素还能识别多泛素。含有CUE结构域的蛋白广泛参与细胞内的信号转导。我们实验室前期的工作发现CUEDC2能够结合孕激素受体(PRB)并且促进孕激素依赖的PRB泛素化降解进而抑制孕激素信号通路,此外还发现CUEDC2通过促进PRB Lys388泛素化抑制其SUMO化进而协同调节PRB的蛋白表达水平。进一步研究发现,CUEDC2作为一个接头蛋白质能够与IKK发生相互作用,通过招募GADD34和蛋白质磷酸酶PP1使IKK复合体脱磷酸失去活性,从而抑制NF-?B信号通路。最新研究表明,在乳腺癌细胞中CUEDC2的高表达是导致乳腺癌患者对内分泌治疗产生耐药的关键原因,CUEDC2通过泛素蛋白酶体降解ER从而导致乳腺癌患者对内分泌疗法耐受。针对CUEDC2的研究提示CUEDC2可能参与多种信号通路反应,发挥着不同的生物学功能。为了更加深入的研究CUEDC2的功能,我们首先需要获得纯度高,特异性强的CUEDC2单克隆抗体。通过CUEDC2全长抗原免疫小鼠,得到产CUEDC2抗体的脾细胞,再与骨髓瘤细胞融合。通过融合细胞的筛选、亚克隆的筛选鉴定及小鼠腹水的采集等一系列步骤,最终我们得到了CUEDC2单克隆抗体。为以后研究CUEDC2的功能奠定了良好的基础。可控的外源基因表达系统是目前细胞系和组织中研究某一基因功能最主要的技术手段之一。受到很好调控的外源基因表达系统能够准确反映活体内的情形并能得到可靠的数据。为了得到tet-off调控的可诱导表达系统的稳定细胞系,需要分别将tet-off质粒和TER重组质粒通过逆转录病毒转染到细胞,但是转染两种逆转录病毒质粒工作量大,繁琐,同时转染效率也不高。很多研究试图建立一个单质粒逆转录病毒模型用来克服此困难。因此我们选择使用p617-neo-T-EGFP-I-tTA4载体构建CUEDC2可诱导表达质粒。p617-neo-T-EGFP-I-tTA4载体是将两部分体系构建到了一个逆转录病毒载体上,同时用无毒性的tTA4替代了tTA,因此该tet-off系统具有更高逆转录病毒的滴定度,并能更加严密的调控外源基因的表达。当DNA受到某些损伤因子(包括物理损伤,化学药物刺激,紫外线照射,离子照射等)的刺激时会激活多条信号通路,包括周期阻滞,DNA修复,衰老和凋亡。前期实验线索提示CUEDC2可能参与细胞周期调控,为了研究CUEDC2在细胞周期调控及DNA损伤引起的周期阻滞中的功能,我们建立了细胞周期同步化方法,并利用紫外线照射作为DNA损伤因子建立了DNA损伤模型,为以后研究CUEDC2功能奠定了基础。