研究背景创伤、感染、肿瘤、先天性疾病等常导致骨缺损,对其进行修复重建的目的是尽可能迅速、完全地恢复骨的结构和功能。自体骨因其具备骨传导性、骨诱导性和成骨活性,故自体骨移植是治疗骨缺损的金标准,但其增加了额外的手术创伤,来源有限,且取骨区有一定的并发症,如感染、巨大的血肿及感觉障碍等。同种异体骨虽然来源广泛,但其存在着免疫原性和致病性等明显缺点,所以并不是最理想的骨修复材料。为了解决这些问题,人们开始研究新型骨替代材料作为骨缺损修复的材料。骨替代材料的研究最早见于1895年的报道,理想的骨替代材料应该具备以下几个特点:①良好的生物相容性;②可生物降解;③骨传导性;④骨诱导性;⑤结构与正常骨类似;⑥便于使用;⑦性价比高。全世界范围内的骨科、神经外科及口腔颌面外科每年进行的植骨手术多达220万台,而其市场价值高达25亿美元。越来越多的可市场化的骨替代材料正在出现,其来源各不相同,可应用于全身各处。它们的组成和作用机制各不相同,所以它们的应用范围也不同。人工合成的骨替代材料为目前研究的热点,种类可大概分为:①生物陶瓷,如生物玻璃、磷酸三钙及羟基磷灰石等;②金属:主要为钛合金、钛涂层及其他金属涂层;③高分子聚合物:聚甲基丙烯酸甲酯、聚乳酸/聚乙醇及共聚物等;④骨水泥:磷酸钙及硫酸钙等。为了综合各种材料的优势,已达到完美模拟自体骨的目的,许多学者将无机材料与有机材料进行结合,创造出各种复合骨替代材料。这些复合材料通常包含以下几个部分:一种利用骨长入的具有骨传导性的基质;具有骨诱导性的可以促进未分化细胞有丝分裂的蛋白,例如各种生长因子;骨原细胞(成骨细胞或前成骨细胞),其在适宜的环境下可以促进骨形成。羟基磷灰石和磷酸钙具有良好的生物相容性,但皆不具备骨诱导性,故近来基于细胞层面的复合材料成为研究热点,主要集中在:①新鲜骨髓;②纯化的、经过扩增培养的骨髓间充质干细胞;③已分化的成骨细胞;④经过基因修饰定向表达BMP的细胞,其目的皆在于增强材料的骨诱导性。在已知的具备骨传导性的材料中引入骨诱导性因子,为最理想的模拟自体骨的途径,且无需额外的手术创伤及并发症。骨替代物未来将从一种单一的空间填充材料转变为一种可改变骨生理的革新性生物材料,这将极大地促进骨组织工程的发展。硫酸钙由于具有良好的生物相容性和可降解性,故成为了在临床上使用历史最为悠久的骨替代材料。研究证明,硫酸钙颗粒的降解率与局部血管长入、新骨形成的速度相一致,且硫酸钙具有可塑性,可以制成各种形状,能够自固化,具有一定的强度,无免疫源性,体内能够降解吸收,适合作骨移植替代材料填充修复骨缺损。相比PMMA骨水泥,硫酸钙在固化过程中不产热,生物降解与成骨活性协调,在骨重建过程中,逐渐被正常骨取代。但其缺陷在于硫酸钙作为一种骨替代材料,仅具有骨传导性,而无骨诱导性。国外学者通过一系列的动物实验及临床研究证实,硫酸钙可以用作单纯的骨替代物、自体骨的添加物、脱钙骨基质的添加物及抗生素的缓释系统。其中,作为自体骨的添加物,硫酸钙与自体骨以50:50的比例进行混合,其效果与纯自体骨相当。这说明了硫酸钙良好的生物相容性,但所有的实验都证明硫酸钙仅具有骨传导性,而无骨诱导性。为了改善硫酸钙无骨诱导性的缺陷,我们在制备中引入了锶元素,以期得到一种骨传导性和骨诱导性兼备的新型骨替代材料。目前,锶元素在骨替代物中的局部应用主要集中在羟基磷灰石方面,不仅已经从分子水平证实了Sr-HA通过激活Ras/MAPK信号通路及其下游的Runx2转录因子促进了骨髓间充质干细胞的成骨分化,从而促进成骨。而且有学者证实了 Sr-HA中释放的锶离子可以促进骨前体细胞的成骨分化,且可以提高碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达。综合以上两点,含锶硫酸钙理论上具备了两者的优势。本项目组研究制备的新型含锶硫酸钙骨替代支架材料,具有良好的生物相容性,将锶作为一种骨诱导性因子引入具有骨传导性的硫酸钙,并在SD大鼠胫骨临界性骨缺损模型中验证了其促成骨作用,符合骨组织工程支架材料的要求。本实验研究是在上述思路下和本课题组前期研究的基础上,采用共沉淀及水热反应技术制备新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙,并对支架的理化性能、力学性能和生物相容性进行综合评价,并在SD大鼠胫骨临界性骨缺损模型中验证了其促成骨作用,为新材料的临床应用提供实验依据。目的1.探讨新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙的制备方法及其性能;2.探讨新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙的动物体内生物相容性和使用安全性；3.探索将新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙植入SD大鼠胫骨15mm2临界性骨缺损,观察其体内成骨情况及修复骨缺损的效果。方法1.新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙的制备及表征1.1共沉淀法制备含锶二水硫酸钙将含有Ca2+和Sr2+的化合物按一定的含锶摩尔比进行混合,加入去离子水制成水溶液,后将含混合液的烧杯放置于磁力搅拌器上,再将含有SO42-的溶液逐滴加入前述混合液中,滴入过程中保持30°C加热、持续搅拌,滴入完毕后维持加热及搅拌3小时。生成的沉淀经过滤、洗涤及干燥后,制成一定比例的含银二水硫酸钙。1.2水热法制备含锶α-半水硫酸钙将步骤(1)生成的产物按质量比固体/液体=15%的液固比与去离子水进行混合,加入1%硫酸铝和0.1%柠檬酸钠作为复合转晶剂,利用水热反应釜在2个大气压130℃下反应6小时,后趁热将沉淀进行过滤、洗涤、干燥及球磨,即制得含锶α-半水硫酸钙。将10%Sr-CaS材料进行X射线衍射、傅里叶红外扫描及差式量热扫描表征评价。按含锶摩尔比1%、5%和10%制备三种Sr-CaS材料,通过万能测试机测试抗压强度和体外降解实验,进行对比分析,探讨含锶量对材料机械强度及降解速度的影响。2 新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙的细胞相容性按国家标准取10%Sr-CaS材料的浸提液,按浸提液浓度将L929细胞接种于96孔板,实验组分别为100μL的浓度为100%、75%、50%、25%浸提液,阴性对照组为100μL相应的对照液,阳性对照组为100μL的0.64%苯酚溶液,每组18个复孔。在倒置相差显微镜下观察L929细胞贴附情况,用酶标仪在490nm波长下测定其光吸收值(A490),记录结果并计算细胞相对增殖率(cell relative grown rate,RGR),最后进行细胞毒性评价。3 新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙的组织相容性3.1按国家标准取10%Sr-CaS材料的浸提液,取浓度为100%浸提原液,然后进行溶血试验及迟发型超敏反应试验。3.2全身亚急性毒性试验:取20只昆明小鼠,雌雄各半,按试验样品接触最大体积规定,实验组以50ml/kg的标准于小鼠腹腔注射浸提液,对照组以生理盐水作为对照,每日一次,持续14天。分别于注射前、第一次注射后1周及第一次注射后2周分别对体重、临床观察项目及各种血常规、血生化项目进行评价,于第一次注射后2周取材大鼠重要器官,进行称重并行病理切片、HE染色、光学显微镜下观察组织反应情况。4 新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙的促成骨能力4.1实验分组A组,空白对照组:骨缺损处不植入任何支架材料;B组,CaS支架组:骨缺损处植入硫酸钙支架材料;C组,5%Sr-CaS支架组:骨缺损处植入5%含锶硫酸钙复合支架材料;D组,10%Sr-CaS支架组:骨缺损处植入10%含锶硫酸钙复合支架材料。30只雄性SD大鼠,60侧胫骨,完全随机分为4组,每组填充15个支架材料,分别于植入后4w、8w、12w取材,4w、8w及12w时各处死10只。4.2 SD大鼠胫骨临界性骨缺损模型的建立麻醉成功后动物取仰卧位,双侧后肢备皮,常规消毒铺巾。取胫骨内侧切口,逐层切开、分离皮下组织及深筋膜,钝性分离肌肉至骨质,切开并用骨膜剥离子剥离骨膜,暴露胫骨中上段皮质骨,在前内侧皮质上距关节面下方10mm水平用2.5mm钻头先钻两个孔,然后用尖刀清除孔间骨质,造成3mmx5mm骨缺损。大量生理盐水冲洗髓腔及骨缺损处,清除残留骨质及骨髓,纱布擦干后按组别分植入骨支架材料。植入移植物时采取完全随机的方式,A组为空白组,造成大鼠胫骨骨缺损模型后不填充任何材料,B组、C组及D组分别植入相应材料。将相应材料充分填塞髓腔以原位凝固,刮除多余材料,闭合伤口。4.3取材及观察指标4.3.1大体观察并记录术后动物的精神、饮食、活动及伤口有无红肿及渗液等情况。4.3.2分别于术后即刻、4w、8w和12w动物处死前作双下肢X线摄片检查,观察各组动物缺损修复情况。4.3.3于术后4w、8w、12w处死动物,取出胫骨标本,对标本骨缺损处进行大体观察。4.3.4取大鼠术后12w后胫骨标本,进行Micro-CT扫描,感兴趣区域(region of interest,ROI)获取连续的Micro-CT横截面图像。利用Micro-CT软件对新生骨进行数据分析。4.3.5分别于术后第4、8、12周处死动物,取出胫骨标本,缺损处保留骨痂,然后将标本做常规脱钙切片,进行HE及Masson三色染色。结果1.含锶α-半水硫酸钙的X射线衍射显示,在14.63°,25.72°和29.80°角度处可见α-半水硫酸钙的特征性三强峰,而锶元素的特征峰也在24.78°处也可观察到。图谱与α-半水硫酸钙的图谱十分类似,这说明锶元素的分布并未对硫酸钙结晶造成影响。热分析结果示,制备材料的结构水含量为6.03%(理论值为6.04%),146.37℃处的吸热峰和174.64℃处的放热峰证实了该材料具备与α-半水硫酸钙类似的结构。2.1%Sr-CaS组的抗压强度与5%Sr-CaS组和10%Sr-CaS组间均有统计学差异(P=0.019,P=0.000),而5%Sr-CaS组和10%Sr-CaS组间差异有统计学意义(P=0.003)。三种材料失重率变化曲线随时间延长均呈上升趋势,且随着含锶量的升高其失重趋势愈加明显,其中10%Sr-CaS组失重趋势最为明显,其在8周时最大失重率可达62.75%,而1%Sr-CaS组在8周时最大失重率为40.91%。3.各实验组不同时间的细胞增殖率:随着时间的增加,各实验组A490呈现增大的趋势,不同时间点各实验组与阴性对照组A490值比较差异均无统计学意义(P>0.05)。而不同时间点各实验组及阴性对照组的A490值与阳性对照组(苯酚)比较差异均有统计学意义(P<0.05)。实验组、阴性对照组不同时间点的毒性反应均为I级,无细胞毒性;而阳性对照组毒性反应均为IV级,有细胞毒性。在以上试验条件下可以认为被试材料浸提液无细胞毒性。4.实验组和阴性对照组各管中红细胞全部下沉,上清液无色透明,表明无溶血现象发生。实验组的溶血率为4.3%<5%,判定为合格,即Sr-CaS骨替代材料不会引起溶血反应。实验结果表明,三个阶段激发后所有动物在两个时间点均无致敏现象发生,阳性激发率为0%,分类为“与阴性对照组无差别”,说明该材料不会引起迟发型超敏反应。两组小鼠在体重、血常规、血生化及重要脏器重量方面差异无统计学差异(P>0.05)。两组小鼠的重要脏器HE染色中可见细胞形态正常,排列规则有序,组织未发现明显的水肿、充血及坏死,说明Sr-CaS骨替代材料的浸提液未对小鼠造成亚急性毒性,Sr-CaS骨替代材料具有良好的组织相容性。大鼠麻醉清醒后呼吸、进食、饮水正常,术后生存状况良好;术后跛行,数日后即可逐渐恢复正常;手术切口正常愈合,无红肿、渗液。X线检查:术后即刻,CaS、5%Sr-CaS及10%Sr-CaS在X片上均表现为局部显著的高密度影,紧密填压骨缺损,界限清晰,而空白组表现为清晰可见的低密度骨缺损区域。术后4周时,CaS、5%Sr-CaS及10%Sr-CaS均表现为较前明显降低的低密度影,其中CaS组密度最低;CaS支架组仅见低密度材料影,5%Sr-CaS支架组骨缺损区填充物密度较前降低,仍较为完整,边缘有少量骨痂形成。术后8周时,CaS、5%Sr-CaS及10%Sr-CaS均已基本降解,X线片无明显表现。CaS支架组骨缺损部位表现为较周围骨质低的低密度影,骨缺损处出现新生骨填充;5%Sr-CaS支架组骨缺损处己为部分为新生骨所填充,且周围骨质密度较高;10%Sr-CaS支架组骨缺损处己为大量新生骨所填充,新生骨质与周围骨质相同;空白对照组骨缺损低密度区域较前减小,边缘模糊,可见少量骨痂形成,但骨缺损区仍清晰可见。术后12周时,4组骨缺损区域均得到不同程度修复。CaS、5%Sr-CaS及10%Sr-CaS3组骨缺损区均得到了完全修复,且新生骨与周围骨质密度均匀一致;空白对照组表现为较周围骨质低的低密度影。Micro-CT分析:空白对照组骨缺损处也出现了新生骨小梁,但数量少且排列疏松杂乱,新生骨内存在大量空腔;而CaS支架组骨缺损处出现了大量新生骨,且排列较为规整,但新生骨内部仍存在少量空腔,髓腔内未见材料痕迹;5%Sr-CaS支架组骨缺损处新生骨排列规则、皮质均匀,但局部仍可见修复不完全,髓腔内仍可见剩余未降解的材料;10%Sr-CaS支架组骨缺损处修复连续、完整,皮质均匀,骨小梁排列规则,髓腔内也可见剩余未降解的材料。结论1.新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙随着含锶量的升高,其机械强度随之下降,且失重率随之升高。2.新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙属于无细胞毒性的生物材料,具有良好的细胞相容性。3.新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙无全身毒性作用,不引起皮肤刺激反应,不具有血液毒性,具有良好的生物安全性,符合作为骨替代材料基本条件。4.SD大鼠胫骨临界性骨缺损模型证实新型骨替代材料含锶α-半水硫酸钙具有良好的骨缺损修复作用,是一种成骨活性良好的新型骨缺损修复材料。