论文部分内容阅读
获得性免疫缺陷综合症（AIDS）与败血症（Sepsis）是威胁人类健康的两大杀手。国际上相关研究及临床治疗都取得了一定进展,但形势依然严峻,更好的疫苗和药物仍待开发。本论文将通过对参与这两类疾病相关重要蛋白质结构的解析阐明其中的部分作用机制,为疫苗或新药物开发提供可能的设计思路。AIDS是由人类免疫缺陷病毒（HIV）感染破坏免疫系统导致免疫效应降低所表现出的综合症状。HIV是具有双链RNA的慢病毒,是一种潜伏期极长的逆转录病毒,分为HIV-1和HIV-2两种类型。而研究较多的为HIV-1型,其90%患者在感染后10-12年内会发展为艾滋病人。然而,在HIV-1感染的人群中,存在一小部分长期不发病的人,他们可以较好控制体内病毒拷贝数并维持较为正常数量的CD4+T细胞,这类人群被称为良性长期不发病病人（lon-term nonprogressors,LTNPs）。相反,易发病的人群则被称为Progressors。全基因组关联分析（GWAS）和相关的免疫试验表明LTNPs表达较多具有保护性的人类淋巴抗原分子（HLA）,如HLA-B*27、HLA-B*57/5801。特别是HLA-B*5801被认为是最具有保护性的HLA,而表达HLA-B*53和HLA-B*5802的人群通常会是progressors。进一步研究表明,有的病人虽然也表达HLA-B*57/5801但依然会成为progressors,有报道指出这是由T细胞间的差异导致，但其中的机制还不清楚。有意思的是,HLA-B*53/57/58三个蛋白具有较高的序列相似性,其中HLA-B*57与HLA-B/58的氨基酸序列具有高度相似性,而HLA-B/5801与HLA-B*5802仅有三个氨基酸的差异，其差异最大位点是第97位氨基酸（R或W）。HLA-B*57/5801均可以递呈HIV蛋白Gag的降解肽段TW1O（TSTLQEQIGW）等刺激T细胞发挥免疫效应。Gag是HIV-1表达的三个结构性蛋白之一,其他两个为Pol、Env,他们的降解产物是T细胞介导细胞免疫的主要启动因子。值得指出的是,HLA-B*57/5801及HLA-B*5301还均可以递呈Gag的降解产物QW9（QASQEVKNW）。HLA-B*5701/LF9、HLA-B*5703/KF11以及HLA-B*5301与HIV-2型Gag降解产物的复合物结构均已被报道,而最具保护性的HLA-B*5801还不曾被报道。这里我们通过变复性的方法获得了HLA-B*5801与QW9及其两个自然突变株（QW9E5D和QW9S3T）的复合物蛋白,并结晶出可用于衍射的晶体。通过对HLA-B*5801三组复合物结构测定与分析,发现QW9中间第5-7位氨基酸残基的构象存在可变性,特别是第七位赖氨酸（K7）与HLA-B*5801的结合存在较强的柔性。这种侧链的柔性可能会直接影响T细胞受体（TCR）对抗原的识别,进而影响T细胞介导的免疫效应。进一步分析HLA-B*58O1与QW9的复合物结构并与已报道的HLA-B*5301结构进行比较,有助于理解T细胞识别B*5301（非保护型HLA）与 B*5801（保护型HLA）递呈抗原的差异性。同时,这也将为抗艾滋治疗方案的研发提供新思路。与病毒感染引发的获得性免疫缺陷综合症不同,败血症是由细菌感染引起免疫系统启动细胞凋亡,并最终导致多器官功能性障碍。目前还没有特别好的药物和方案用于治疗败血症,临床上主要依赖抗菌剂和护理结合治疗,但存在抗药性、抗生物毒性、内毒素、细胞死亡及机能障碍等问题。Caspases介导细胞凋亡的相关研究已有很多报道,但至今在临床试验上仍没有caspases抑制剂被通过,对新抑制剂的发现仍是生物医学领域的一项挑战。人们对抗凋亡的研究更多是集中在内在调控因子上,包括凋亡抑制性蛋白Bcl-2家族及分子伴侣蛋白家族。在分子伴侣蛋白中,Hsp90在进化上是一个非常保守的分子,在调控细胞内稳及应激反应中均扮演非常重要的角色。Hsp90的众多相互作用蛋白已陆续被报道,特别是与激酶和激素受体相关的研究。Hsp90在动力学上非常活跃,依赖其自身ATPase活性调控蛋白构象以稳定与不同蛋白的相互作用。由于Hsp90在肿瘤癌细胞中具有显著抗凋亡和自我保护功能,大量的Hsp90抑制药物被开发用于化疗。然而,对于激活剂激活Hsp90及其相关通路来保护正常体细胞死亡的报道至今还没有。我们在筛选新型抗凋亡药物中发现,在啮齿类动物败血症和脑中风模型中,α1肾上腺素受体拮抗剂特拉唑嗪（Terazosin,TZ）可以缓解相关症状。进一步功能实验显示,TZ可以有效抑制细胞凋亡、保护应激细胞。结合化学、分子生物学方法我们获得并鉴定出TZ的靶点蛋白——磷酸甘油酸激酶-1（Phosphoglycerate Kinase 1,PGK1）。功能上,PGK主要催化二磷酸腺苷（ADP）和1,3-二磷酸甘油酸（1,3BPG）反应生成三磷酸腺苷（ATP）和3-磷酸甘油酸（3PG）,为糖酵解提供中间产物,也为生命活动提供直接的能量。结构上,PGK由两个结构域组成,一个结合ADP或ATP,另一个结合1,3BPG或3PG。这两个结构域之间可以实现开放（open）和关闭（closed）两种状态的切换,以实现底物的结合、反应的进行和产物的释放。通过对PGK1/TZ复合物结构的测定,我们第一次报道了PGK1的新结合位点,而该位点与ADP/ATP结合位点共有一块重叠区域。结合酶学及生化实验结果分析,本文第二部分阐述了TZ通过激活胞内PGK1进而激活Hsp90相关通路抑制细胞凋亡的可能机制。