糖作为生命体重要的物质结构之一广泛地参与了各种生物学功能,其中蛋白糖基化修饰是糖结构的一种重要存在形式。大于50%的哺乳动物蛋白和超过70%的生物蛋白类药物都具有糖基化。糖基化参与了蛋白折叠、跨膜转运、细胞粘附、免疫应答等一系列蛋白功能。单克隆抗体药物的糖基化与药物疗效、药物代谢、药物稳定性与免疫原性等成药性关系密切。但由于蛋白糖基化的种类繁多、结构复杂的特点,精确调控蛋白糖基化结构依然是一项具有挑战性的技术难题与瓶颈。本文通过发展和完善一套酶催化蛋白糖基化修饰技术,针对抗体药物糖链结构进行糖工程改造,在新型糖工程抗体和基于糖链的定点抗体药物偶联物（ADC）的设计和研发,以及细胞表面特定N-寡糖选择性编辑和标记技术等方面,进行了较为深入地研究。通过建立“一锅法”糖工程技术制备糖链优化的抗体药物,提高了抗体依赖性细胞毒作用和肿瘤杀伤效果,改善了抗体药物稳定性。同时,通过非天然糖链底物的设计将标记基团定点引入抗体糖链,随后与小分子药物偶联,实现基于糖链的定点抗体药物偶联技术,克服了传统ADC药物随机偶联带来的偶联位点和数量不均一、质量难以控制、药效药代重现性差等问题。进一步地,本文利用酶催化蛋白糖基化改造工具,建立了新颖的细胞表面糖链编辑技术,实现了糖链亚型选择性编辑和标记,为细胞糖链的结构与功能研究提供了新的化学生物学方法。本文第一部分工作主要建立多样化糖链底物制备技术,完善高效的抗体糖工程改造技术,并用于新型糖工程抗体药物的设计与研发。单克隆抗体药物在治疗肿瘤、炎症、自身免疫等疾病中发挥重要的作用,是生物技术药物的主要研发领域,发展基于新技术的高效低毒抗体药物是新型治疗性单抗的研发热点。其中,通过控制抗体Fc糖链结构设计新颖的糖工程抗体,提高药物的肿瘤杀伤效果,优化其成药性,是单抗药物的研发新思路。常规表达的抗体糖基化位点往往具有不均一的糖型结构,而通过改造哺乳动物细胞表达体系中的糖转移酶来进行抗体糖工程调控,往往涉及多种糖转移酶,对不同糖型结构需要不同的表达体系改造,对不同的抗体需要重新优化其表达工艺,这些局限不利于开展对新型糖工程抗体的糖型结构设计与筛选。本文在前期研究基础上,发展和优化了糖苷内切酶催化抗体糖工程技术,通过糖苷内切酶的野生型水解酶和突变型合成酶活性,利用合成多样化糖链底物,高效制备具有各种均一糖结构的抗体,用于新型糖工程抗体筛选。首先,利用鸡蛋中提取得到的唾液酸糖肽作为均一糖链底物前体,我们发展了化学法和酶法的快速衍生技术,建立了寡糖噁唑啉底物的半合成方法,合成了4种单一结构天然糖链及其噁唑啉,用于糖工程抗体的制备。然后,利用野生型Endo-S糖苷内切酶和岩藻糖水解酶对抗体的非均一糖链进行去糖基化和去岩藻糖化,再通过Endo-S D233Q突变型合成酶和均一结构糖链噁唑啉底物,发展了“一锅法”糖工程技术,合成了4种均一岩藻糖化糖型抗体。该方法的建立极大地缩减了糖工程抗体制备的繁琐流程,提高了糖工程抗体的制备效率,为结构多样化的糖工程抗体的筛选和进一步成药性优化提供了高效的技术基础。本文第二部分工作是基于抗体糖链的新型定点抗体药物偶联物研发。抗体药物偶联物（Antibody-Drug Conjugates,ADC）通过一个连接子将小分子细胞毒药物共价偶联到具有高度肿瘤特异性识别的抗体上,实现了肿瘤靶向输送药物,降低细胞毒药物的毒性,提高抗体药物的治疗效果。传统ADC药物主要采用随机偶联方法将小分子偶联到抗体的赖氨酸或半胱氨酸侧链上,其偶联位点和偶联小分子数量高度不均一,为制备工艺研究、质量控制、药效药代优化都带来一系列问题。如何发展定点定量偶联技术是新型ADC药物研发的重点。我们基于建立的“一锅法”酶催化抗体糖工程技术,在改造抗体Fc糖链结构时引入带有特殊反应基团如叠氮或炔基标记的非天然糖链,然后与小分子药物通过点击化学进行偶联,实现ADC在Fc糖链上的定点定量偶联,提供在糖链结构和小分子偶联位点和数量高度均一的ADC分子设计。利用糖链底物末端唾液酸和半乳糖的结构特点,分别采用NaIO₄选择性氧化法和半乳糖氧化酶催化法在糖链非还原末端引入醛基官能团,然后通过成肟反应、还原胺化等反应引入叠氮或炔基标记,制备相应的非天然糖链底物。酶催化抗体糖工程技术将这些标记的糖链底物定点连接到抗体Fc区域Asn297糖基化位点,制备得到具有不同官能团结构糖链的帕妥珠2种,新抗体1种,利妥昔2种,赫赛汀7种。随后,我们设计合成了一批具有不同连接方式的小分子药物用于抗体的定点偶联,获得了具有特定结构、连接方式、连接数量的定点ADC化合物25个,包括采用不同抗体靶向策略、偶联两种不同药物的“双药”策略、不同连接子释放策略等多样化结构设计。抗肿瘤活性评价显示,基于糖链的定点ADC的活性依赖于可裂解连接子片段如Val-Cit结构,促进其小分子的释放,IC₅₀达到0.1 nM水平。该部分工作为ADC的定点偶联提供了新的技术思路,探索了基于糖链定点ADC药物的设计策略与构效关系,为此类定点ADC药物研发提供了研究基础。本文第三部分工作主要建立和发展了新颖的细胞表面糖链编辑和标记技术,利用Endo类糖苷酶催化蛋白糖基化改造技术,实现细胞糖链亚型选择性编辑和荧光标记。细胞表面蛋白糖基化对细胞间的相互作用、受体结合、免疫调节、肿瘤的发生分化及其逃逸、细菌和病毒的入侵等生物学功能密切相关。基于化学生物学的细胞表面糖链标记方法是蛋白糖基化功能研究和可视化研究的一个重要手段。然而由于糖基化的种类与结构纷繁复杂,针对精确糖型的选择性标记方法的建立依旧充满挑战,是该领域亟需攻克的难题和瓶颈。我们利用Endo类糖苷内切酶的底物识别特异性,选择性的水解细胞表面N-糖链亚型结构,并在突变酶的作用下实现了合成的单一糖链底物的转糖基化,从而选择性将细胞糖链亚型编辑为精确结构的糖型。进一步地,利用叠氮标记的非天然糖链底物,我们实现了细胞糖链亚型的选择性标记。通过采用EndoF3和EndoM等酶,我们对5种不同细胞表面的核心岩藻糖化和非岩藻糖化N-糖链亚型,分别进行了糖链编辑和标记,并运用FRET技术对标记特异性进行了验证。该方法的建立,首先开发了一种选择性标记特定亚型糖型的手段,实现N-糖基化的亚型特异性标记;其次,该方法可以将特定亚型的糖链混合物结构,编辑为结构单一的糖型,为研究精确糖型对于细胞表面糖蛋白结构以及功能的影响提供了新颖而有力的工具,推动化学糖生物学研究方法的发展和蛋白糖基化生物学功能的研究。本文第四部分工作为基于糖链的FRET荧光探针的设计与合成及其在Endo类糖苷酶检测与细菌检测中的应用。Endo类糖苷酶主要来源于细菌,不同细菌分泌出具有不同糖链底物识别特异性的Endo糖苷酶,因此,利用其底物特异性设计相应荧光探针,可以实现Endo糖苷酶和相应细菌的选择性检测。荧光共振能量转移（Forster Resonance Energy Transfer,FRET）是具有能量叠加区域的两个荧光小分子相距小于10 nm时产生的一种能量转移现象,我们基于唾液酸糖肽结构与EndoM糖苷酶的底物特异性,在寡糖链两侧分别标记Cy3/Cy5荧光分子,并成功测定了其FRET效应及其在EndoM水解后FRET现象的消失,可以用于EndoM酶活性检测和相关细菌检测。我们进一步设计了基于抗体的FRET探针用于EndoS酶的检测。该类荧光试剂的设计可以用于Endo酶类化合物的发现、鉴定以及活性测定等研究,具有广泛的应用前景。本文的最后一部分是全文总结内容。该部分简略的总结了整个博士生研究阶段所进行的工作,并对该方向接下来可以进行的系统性研究或方法进行了展望。综上所述,本论文系统地研究了糖苷内切酶在糖工程抗体制备、基于糖链的新型定点抗体药物偶联物制备、细胞表面特定糖型糖链标记等方面的应用,成功的建立了寡糖噁唑啉的“一锅法”合成方法、“一锅法”抗体糖基化改造方法、糖链定点ADC化合物制备以及活性评价方法、细胞糖链标记方法等,为进一步的糖苷内切酶的应用以及糖链定点ADC化合物研究奠定了良好的基础,提供了理论指导和实践经验。