海洋微生物来源的天然产物具有丰富的结构与活性多样性,已成为新型药物研发的新热点。Didemnins为一类海洋微生物来源的天然产物,最早是从地中海海鞘(Aplidiumalbicans)发现的,具有复杂的环状缩肽结构,目前已鉴定的didemnins包括didemnin B,dehydrodidemnin B(aplidine),nordidemnin B以及didemnin X/Y。它们由α-变形杆菌门的Tistrella mobilis(运动替斯崔纳菌)与Tistrella bauzanensis等细菌产生,具有抗肿瘤、抗病毒以及免疫抑制等活性。目前,aplidine已进入临床III期,主要适应症为多发性骨髓瘤、淋巴瘤等。Didemnins为非核糖体肽(NPRS)/聚酮合酶(PKS)杂合型化合物,用于合成didemnin B的生物合成基因簇已被克隆,大小约73kb左右。但由于这类细菌遗传操作困难,didemnins产量非常低,大大制约了这些药物的研发进度。创建微生物异源合成体系,实现didemnins高效合成,可以有效解决didemnins的药源问题。为此,本研究拟从运动替斯崔纳菌出发,运用RNA介导的CRISPR/Cas9核酸内切酶结合酵母转化依赖重组技术(TAR)(Cas9-TAR)进行didemnin B生物合成基因簇的克隆,为后续创建异源合成体系奠定基础。首先,我们对购买的2株运动替斯崔纳菌进行了PCR及发酵验证,经过PCR产物测序及发酵产物的LC-MS分析,证实这2株细菌都具有didemnin B合成能力。提取其中一株运动替斯崔纳菌的全基因组,运用Cas9-TAR进行完整didemnin B合成基因簇的一步法克隆,但多次尝试均告失败。为此,本研究改变策略,将基因簇分成2段(did L和did R)进行分别捕获,然后将它们拼接成完整didemnin B基因簇。以pCAP01为出发质粒,构建了分别含有did L上下游同源区域(各约1 kb)的捕获质粒pCAP-did L-HR和含有did R上下游同源区域(各约1 kb)的捕获质粒pCAP-did R-HR。为了后续2个片段的拼接,did L和did R之间设计有80 bp左右的重叠区。同时,设计、筛选可以引导Cas9高效切割基因组上did L和did R上下游DNA的sg RNA,通过sg RNA-Cas9切割基因组,以释放目标基因簇片段。通过原生质体转化,将获得的捕获质粒和经酶切的基因组同时导入酿酒酵母,经营养缺陷型筛选及PCR验证,鉴定获得已捕获did L和did R的阳性酵母克隆。提取质粒,转化大肠杆菌,经酶切、PCR及测序验证,获得含有did L和did R的重组质粒(pCAP-did L和pCAP-did R)。由于pCAP01可容纳的DNA比较有限,一般低于60 kb,因此,为了进行完整基因簇的拼接,本文在细菌人工染色体质粒pCC1BAC基础上,加入了酵母筛选和复制元件(ARSH4/CEN6-TRP1)以及用于在放线菌中进行基因组整合所需的抗性和位点特异性性重组元件(ΦC31-acc(3)IV),构建了用于捕获大型基因簇的克隆载体pCL01。在此基础上,构建用于拼接did L和did R的重组质粒pCL01-HIS-HR(分别含有did L和did R的同源区,各1.5 kb),其中HIS为组氨酸营养缺陷型筛选标记,通过该筛选标记,可以大幅降低载体自连背景。另外,为了降低因pCL01-HIS-HR载体未能有效酶切产生的背景,我们将载体拆分成3段,分别通过PCR扩增获得相应的线性片段,每个片段相邻区域以及与did L和did R两端含有约500 bp的重叠区。同时,将pCAP-did L和pCAP-did R进行Nhe I/Spe I双酶切,回收获得did L和did R基因簇片段。随后,将之前准备好的pCL01-HIS-HR线性片段(共3段)与did A和did B基因簇片段共同转化酿酒酵母。同样,通过营养缺陷型筛选及PCR验证,成功筛选到含有完整didemnin B生物合成基因簇的酵母克隆,转化大肠杆菌EPI300进行扩增,经过PCR、酶切及测序验证,获得含有完整基因簇的BAC质粒pCL01-didemin B。