背景世界卫生组织指出,精神疾病是21世纪人类身心健康的主要杀手。尽管关于精神疾病的病因和治疗取得了一些研究进展,但对于这一类疾病详细的分子细胞机制仍不清楚。研究表明,创伤后应激障碍,强迫症,焦虑症等精神疾病的发生与个体对恐惧记忆消退的减慢有关系。因此,深入了解记忆形成和消退的分子机制,对精神疾病的预防、诊断和治疗具有重要意义。学习记忆过程中大脑皮层存在着长时程增强等突触可塑性改变。突触结构的重排和新突触的形成是长时程增强的一个可能机制。肌动蛋白是突触的主要结构成分,纤维状肌动蛋白多聚体与球形肌动蛋白单体之间可发生动态的转换,在突触可塑性调节和学习记忆中发挥重要作用。研究表明,海马中的肌动蛋白重排在环境依赖性恐惧记忆的消退和整合中发挥重要作用。外侧杏仁体中的肌动蛋白重排参与了线索依赖性恐惧记忆的整合过程。近期研究表明,杏仁体和背侧海马的肌动蛋白重排在药物撤退性厌恶记忆的形成和整合中发挥作用。上述研究从功能上证实了肌动蛋白重排在学习记忆中的作用,但肌动蛋白重排如何发挥其作用及其发挥作用的结构基础尚不清楚。本研究应用条件性味觉厌恶模型及透射电镜技术,探讨肌动蛋白重排相关的突触结构改变在不同脑区和不同记忆过程中的作用。条件性味觉厌恶(Conditioned Taste Aversion, CTA)是大脑皮层参与的一种经典的条件反射,在此学习记忆过程中动物将新异性味觉这种条件刺激与随后出现的胃肠不适的非条件刺激相偶联。与其他学习记忆模型相比,条件性味觉厌恶具有以下特点：首先,条件刺激与非条件刺激经过一次偶联就可以形成。第二,这种条件反射一旦形成,维持时间较长。除此之外,条件刺激与非条件刺激之间存在相对较长时间间隔仍可形成此反射。因此,应用条件性味觉厌恶这种模型,研究者可以在不同时间点进行药物干预,从而研究学习记忆不同阶段(如形成,整合,再现,消退)的作用及其分子机制。研究表明,参与CTA记忆形成的脑区主要包括岛叶、杏仁体、丘脑、脑桥臂旁核和延髓孤束核等,参与CTA记忆消退的脑区主要包括腹内侧前额叶、岛叶、杏仁体等。本课题通过研究在CTA某一记忆过程的不同脑区及特定脑区在不同记忆过程和阶段是否存在突触形态结构的改变,进而研究这种结构改变与肌动蛋白重排的功能相关性。通过进一步研究影响肌动蛋白重排的分子机制和干预措施,从而对临床精神疾病的预防和治疗提供理论基础。目的1.研究在CTA形成和消退不同阶段突触的数目和形态结构改变。2.研究肌动蛋白重排在学习记忆不同阶段的功能,是否与突触形态改变相关。3.研究特定脑区肌动蛋白重排在不同记忆过程及同一记忆过程不同阶段是否发挥相同作用。方法1.条件性味觉厌恶(CTA)CTA记忆获得：在CTA条件反射模型中,条件刺激是0.1%糖精钠,非条件刺激是腹腔注射0.15M氯化锂。CTA的行为学过程主要包括3个阶段：适应期、训练期和测试期。适应期大鼠限水,每天饮用自来水10分钟,连续3天以上。在训练期,给予0.1%糖精钠10分钟,40分钟后腹腔注射0.15M氯化锂,形成新异性味觉刺激和胃肠道不适刺激的偶联。测试期每天给予6个水瓶进行测试,其中3瓶为自来水,3瓶为0.1%糖精钠,随机排列,饮用10分钟。记录饮水量、饮用糖精钠水量并计算厌恶指数(Aversion index, Al)。Al=饮水量/饮用液体总量×100%,以Al值的高低评价大鼠对CTA记忆的获得情况。CTA记忆消退形成新异性味觉刺激和胃肠道不适刺激的偶联后72小时进行测试,连续测试6天,每天给予6个水瓶进行测试,其中3瓶为自来水,3瓶为0.1%糖精钠,随机排列,饮用10分钟。根据Al值的变化来评价大鼠对CTA记忆的消退情况。2.透射电子显微镜技术在CTA记忆形成或消退的特定时间点,将动物进行灌流,取出脑组织,迅速分离出腹内侧前额叶、岛叶、杏仁体等组织,进行固定、脱水、包埋、超薄切片、染色,应用透射电子显微镜对突触超微结构进行观察分析。突触体密度(synapse density)测定：应用经典的NA/d方法进行突触密度的统计学分析。突触后致密斑长度(PSD length)测定：应用MetaMorph软件进行测定。3.免疫印记技术在CTA记忆消退的特定时间点,迅速分离出腹内侧前额叶的两亚核团：边缘前皮质(PrL)和缘下回(IL),分别提取突触体膜蛋白,分离Total-actin, F-actin与G-actin。应用免疫印记技术对突触体部位的F-actin与G-actin比值进行分析。4.药物干预应用立体定位仪,根据前囟点为零点的三维坐标双侧脑内埋管至特定脑区。动物手术恢复一周后进行行为学实验。根据研究目的不同,在CTA训练前后不同时间点,脑内微量注射肌动蛋白聚合抑制剂,观察动物行为学的改变。结果1.肌动蛋白重排在条件性味觉厌恶记忆形成中的作用1.1 CTA短时记忆形成过程大鼠特定脑区内突触的改变应用透射电镜技术,我们研究了CTA短时记忆(short-term memory, STM)过程基底外侧杏仁体(BLA)、岛叶(IC)和边缘前皮质(PrL)的突触结构改变。结果发现：CTA短时记忆过程中IC的突触后致密斑(PSD)长度较对照组明显增加(F(4,16)=52.127,p<0.01)。PrL和BLA的PSD长度没有明显变化。IC、PrL和BLA的突触密度没有明显变化。CTA短时记忆形成过程中IC的PSD长度增加,是突触传递效能增加的形态学表现,提示IC参与了CTA短时记忆的形成。1.2 CTA长时记忆形成过程中大鼠特定脑区内突触的改变进一步,我们研究了CTA长时记忆(long-term memory, LTM)过程中BLA、IC和PrL的突触结构改变。电镜结果发现：经过CTA长时记忆,IC和PrL的PSD长度和突触密度与对照组相比明显增加,具有统计学差异[IC (PSD length:F(4,16)= 11.342, p<0.01; synapse density:F(4,17)= 3.887, p<0.05), PrL (PSD length:F(4,16)=8.997, p<0.01; synapse density:F(4,15)=5.028, p <0.01)]。BLA的突触密度和PSD长度与对照组相比,没有明显变化。综上结果表明,在CTA长时记忆形成过程中,除了PSD长度增加之外,在记忆形成的晚期阶段还出现了新突触的形成。说明在CTA短时记忆和长时记忆形成过程中存在着不同的突触结构变化。1.3大鼠不同脑区肌动蛋白重排对CTA记忆获得的影响前期研究结果表明在CTA短时记忆形成过程,IC出现PSD长度增加,但是CTA短时记忆的获得是否在功能上依赖于肌动蛋白重排仍不清楚。为解决这一问题,在CTA训练前30min分别微量注射溶剂和肌动蛋白聚合抑制剂cytochalasin D (cyto D)或latrunculin A(lat A)至BLA、IC和PrL, CTA训练后4小时进行行为学测试。结果发现：与溶剂对照组相比,cyto D或lat A注射入IC,动物的厌恶指数在CTA训练后4小时明显降低(F(2,21)=16.651,p<0.01)。而cyto D或lat A注射入BLA和PrL,动物的厌恶指数未见明显变化。同时,对IC溶剂和cyto D微量注射组进行电镜分析,发现cyto D注射组的PSD长度较溶剂对照组明显减小(t(7)=3.904, p<0.01)。提示IC的肌动蛋白重排参与了CTA短时记忆的获得,并与突触改变相关。1.4大鼠不同脑区肌动蛋白重排对CTA记忆整合和记忆再现的影响之前的研究结果表明：在CTA短时记忆和长时记忆形成过程中存在不同的突触形态改变,接下来我们研究了由短时记忆转化为长时记忆的过程即记忆整合过程中是否存在肌动蛋白重排的作用。为了确保各组大鼠都获得相同的短时记忆,我们在CTA训练后4小时分别微量注射cyto D或lat A至BLA、IC和PrL,在CTA训练后72小时进行行为学测试,结果发现：与溶剂对照组相比,IC和PrL中cyto D和lat A微量注射组大鼠的厌恶指数明显降低(IC F(2,23)=33.125,p<0.01,PrL,F(2,27)=33.605,p<0.01),提示长时记忆受到损害。而cyto D和lat A微量注射入BLA,大鼠的厌恶指数未见明显变化。同时,对IC和PrL溶剂和cyto D微量注射组进行电镜分析,结果发现：两个脑区cyto D注射组的PSD的长度和突触密度较溶剂对照组明显降低(IC,synapse density:t(6)=4.251,p<0.01; PSD length:t(7)=4.404,p<0.01,PrL,synapse density:t(7)=4.338,p<0.01; PSD length:t(7)=4.027,p<0.01).CTA长时记忆的损害也可能是由于记忆的提取(再现)过程障碍所导致。因此,为了排除记忆再现的障碍,在长时记忆测试前微量注射cyto D和lat A至各脑区,结果发现,与溶剂对照组相比,cyto D和lat A在长时记忆测试前微量注射并不能影响动物获得CTA长时记忆。因此,肌动蛋白聚合抑制剂微量注射入IC或PrL,影响了CTA记忆的整合过程。2.肌动蛋白重排在条件性味觉厌恶记忆消退中的作用2.1 CTA记忆消退过程中大鼠腹内侧前额叶不同亚区突触的改变既往研究表明,边缘前皮质(PrL)主要参与恐惧记忆的表达,缘下回(IL)主要与记忆消退的再现有关系。腹内侧前额叶的肌动蛋白重排是否参与了CTA记忆消退过程,以及是否出现突触形态改变之前未见相关报道。应用透射电镜技术,我们研究了CTA记忆消退过程中腹内侧前额叶的两个亚核团PrL和IL的突触结构变化。结果发现, CTA消退中PrL的突触密度无明显变化,而IL的突触密度较空白对照组和CTA非消退组相比明显增加(F(2,8)=26.455, p<0.01)。CTA记忆消退过程能够诱导IL脑区突触密度的增加而PrL脑区的突触密度没有明显变化,提示IL可能参与了CTA记忆消退过程,而PrL可能不参与此过程。2.2 CTA记忆消退过程中大鼠腹内侧前额叶不同亚区突触F-actin的改变上述研究表明,记忆消退过程诱导IL的突触密度增加,突触的形态学改变与突触部位F-actin的含量密切相关。为探讨肌动蛋白重排是否在CTA记忆消退过程中发挥作用,应用免疫印记技术,我们研究了CTA记忆消退过程中PrL和IL突触体F-actin与G-actin比值的变化。结果发现：与CTA非消退组相比,CTA消退训练后PrL的F-actin与G-actin比值没有明显改变,而IL的F-actin与G-actin比值明显增加(F(1,5)=71.974,p<0.01)。上述结果提示：IL脑区的肌动蛋白重排参与了CTA记忆消退过程,并与突触密度增加与有关。2.3大鼠IL的肌动蛋白重排在CTA记忆消退行为学中的作用上述研究表明,记忆消退过程导致IL的突触密度及F-actin/G-actin比值增加,但是在功能上CTA记忆消退是否依赖于肌动蛋白重排仍不清楚。为了进一步解决这一问题,应用脑内埋管定点微量注射技术,我们在CTA消退训练后立即给药,连续注射5天并测试6天,观察IL微量注射cyto D后动物的行为学改变。结果发现:cyto D微量注射入IL后,动物CTA消退明显减慢(Day1, F(1,10)=0.019,p>0.05,Day2,F(1,9)=10.832,p<0.05,Day3,F(1,9)=37.895,p<0.01,D ay4,F(1,9)=15.488,p<0.01,Day5,F(1,10)=56.723,p<0.01,Day6,F(1,5)=29.794,p<0 .01)。提示：IL脑区的肌动蛋白重排在功能上参与了CTA记忆的消退过程。2.4 IL的肌动蛋白重排在CTA记忆消退不同阶段中的作用进一步,我们研究了IL脑区的肌动蛋白重排在CTA记忆消退不同阶段中的作用。在正常生理条件下,CTA训练后72小时进行测试,在测试后2小时就出现记忆的消退。为观察IL脑区的肌动蛋白重排在CTA记忆消退获得中的作用,在CTA训练后72小时进行首次测试,测试后立即在IL内微量注射cyto D, CTA训练后73小时、74小时和75小时进行第二次测试。结果发现：与溶剂对照组相比,CTA训练后74小时和75小时cyto D微量注射组厌恶指数明显增高(2h,F(1,9)=55.349,p<0.01,3h,F(1,8)=3.885,p<0.05)。提示IL的肌动蛋白重排参与了CTA短期消退的获得。为观察IL的肌动蛋白重排在CTA记忆消退整合阶段中的作用,在CTA训练后72小时进行测试,74小时再次测试,测试后动物随机分为2组,分别微量注射溶剂和cyto D至IL,在CTA训练后96小时进行第三次测试。结果发现,cyto D微量注射组与溶剂对照组相比厌恶指数没有明显差异。提示IL的肌动蛋白重排不参与CTA消退的整合过程。结论：1.CTA记忆形成过程中突触形态结构和数目发生改变,且存在脑区特异性和时间特异性(表1)。2.CTA记忆形成过程中存在脑区特异性的肌动蛋白重排。3.同一脑区的肌动蛋白重排在不同记忆过程中发挥不同作用。4.CTA记忆消退阶段存在新突触的形成,证实记忆消退也是一个新的学习过程。5.记忆形成和消退阶段PrL和IL的肌动蛋白重排发挥着不同的功能。