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目的炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种特发性的肠道炎症性疾病,常累及回肠、结肠及直肠。目前普遍认为肠黏膜屏障的损伤是IBD患者肠道中较为常见的病理学改变,致病机制复杂,其主要原因为肠道上皮细胞的分化异常。现有研究结果表明,Notch信号通路在肠道上皮细胞的分化过程中发挥主要调节作用。岩藻多糖是一种主要来源于褐藻的硫酸盐碳水化合物,研究显示其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用。本研究结合生物信息学分析方法,基于Notch信号通路,探讨岩藻多糖(Fucoidan,FUC)对人正常结肠上皮细胞(NCM460)炎症损伤的保护作用。方法1.生物信息学分析从Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中下载GSE55651数据集的原始数据,利用R语言对数据进行预处理后筛选出差异表达基因。利用DAVID数据库和蛋白互作网络分析,筛选出关键的靶基因。2.建立细胞炎症损伤模型、细胞处理及分组体外培养NCM460细胞株,细胞分组如下:(1)空白组:仅添加完全培养基,不含细胞;(2)对照组:使用完全培养基培养细胞;(3)LPS诱导组:在体外培养的细胞中加入脂多糖(LPS,1mg/L)进行干预,构建炎性损伤的细胞模型;(4)LPS+低、中、高剂量岩藻多糖组:采用LPS干预细胞构建细胞炎症损伤模型后,分别用低、中、高(50、100、200μg/L)浓度岩藻多糖完全培养基孵育细胞;3.检测方法采用CCK8法检测各组NCM460细胞的相对存活率;酶联免疫吸附测定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)测定各组细胞培养液中炎性因子IL-6及TNF-α水平;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测各组细胞IL-6、TNF-α、Notch-1、Hes-1及Math-1 mRNA的表达水平;4.统计学处理采用SPSS 20.0软件进行统计学分析,实验数据以均数±标准差((?)±s)形式表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用LSD-t检验,以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果1.生物信息学分析结果显示:我们从3个正常对照组样本和3个LPS诱导后炎症损伤组样本中得到了172个差异基因,包括27个下调的差异基因和145个上调的差异基因。GO分析显示这些差异主要参与炎症反应、免疫反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控等过程。KEGG通路富集分析显示这些差异基因主要参与TNF信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用等。通过PPI网络分析,发现了4个关键基因:IL-6、STST1、IL-1b和IRF7。结合其他相关文献报道后,最终从此4个关键基因中选取进行后续实验的差异基因为IL-6。2.CCK8实验结果提示:LPS干预能显著抑制NCM460细胞的增殖,其细胞存活率明显低于对照组(P<0.05);而FUC能促使炎症损伤后的细胞增殖,FUC处理后细胞的相对存活率显著高于LPS诱导组(P<0.05),且呈剂量依赖性。3.ELISA实验结果提示:LPS干预能明显诱导NCM460细胞分泌炎性因子IL-6及TNF-α,LPS组细胞培养液中炎性因子水平显著高于对照组(P<0.05);而细胞经过各剂量FUC处理后,培养液中的IL-6及TNF-α水平与LPS诱导组相比均显著降低(P<0.05)。4.qRT-PCR结果显示:与对照组比较,LPS诱导组结肠上皮细胞中Notch-1、Hes-1、IL-6、TNF-αmRNA的表达水平显著升高(P<0.01),Math-1 mRNA的表达水平显著降低(P<0.01)。与LPS诱导组相比,低、中、高剂量FUC组结肠上皮细胞中Notch-1、Hes-1、IL-6、TNF-αmRNA的表达水平显著降低(P<0.01),Math-1 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)。结论1.FUC可明显缓解由LPS诱导的细胞炎症损伤,降低炎症反应程度,提高细胞相对存活率。2.FUC对LPS诱导的细胞炎症损伤的保护作用,可能与Notch-1信号通路有关。