猕猴桃细菌性溃疡病是猕猴桃产业最具毁灭性的病害,于1984年在日本首次发生,近年在世界大部分猕猴桃主栽区流行开来,已成为重要的世界性病害。该病害危害严重、流行速度快,但难以有效防治。该病害由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种(Pseudomonas syringae pv.actinidiae,Psa)引起,至少由4个遗传差异的生物型(biovar)群体组成,其中biovar 3为全球普遍流行群体,而biovar 1、2和5仅在日本或韩国流行。然而,作为猕猴桃原产国和最大生产国的中国,虽然早在1986年已发生该病害,但是病菌特征和群体结构尚未充分明确,造成了病害防治的盲目与被动,需要系统研究。为了有针对性地开发新的防治措施,迫切需要明确病菌的致病机制。目前,多个研究小组利用植物病菌互作的蛋白组、次级代谢产物分离、基因敲除等方法,发现了一些潜在致病因子间接或轻微影响致病力,但仍未充分发现Psa的关键致病因子。因此,本研究对陕西猕猴桃溃疡病菌的遗传结构和致病力分化特征进行研究;以此为基础,进一步对强弱致病菌株进行系统分析,以明确Psa的致病相关因子及其参与的致病机制。具体结果如下:1)明确了陕西Psa的群体遗传结构和致病力分化特征。本研究从陕西省猕猴桃栽培区的90个果园的8个主栽品种和砧木的病枝、病叶、病花和病树根部分离获得106个细菌分离物,通过多相分类技术将其鉴定为Pseudomonas syringae pv.actinidiae(Psa);随机选择其中20株接种猕猴桃枝条,均能引起溃疡症状,并能从病部重新分离获得遗传特征一致的菌株;说明陕西省猕猴桃溃疡病菌为Psa。采用Rep-PCR和基于5个看家基因(acnB-gltA-gyrB-pgi-rpoD)的多位点序列分析(multi-locus sequence analysis,MLSA)对上述20个菌株进行分析,发现其均为biovar 3(简称为Psa3);进一步对其中的5株进行全基因组序列分析,与MLSA结果一致。本研究建立了三种病菌室内接种方法,包括离体枝条伤口接种、离体叶片无伤喷菌接种、叶盘真空渗透接种,并优化了接种条件,三种方法均能有效评价病菌致病力和寄主抗病性。使用离体猕猴桃枝条伤口接种方法对上述菌株进行致病力评价,发现不同菌株之间存在显著的致病力分化,且致病力分化与菌株地域来源、寄主品种和危害的组织类型(枝条和叶片)均不相关。其中,一株分离自秦美猕猴桃(Actinidia deliciosa cv.QinMei)病枝的菌株M227致病力最弱,而来自红阳猕猴桃(Actinidia chinensis cv.HongYang)病枝的菌株M228致病力最强,为解析病菌致病机制提供了材料和思路。2)强弱致病菌株的外泌蛋白组和全基因组比对分析表明T3SS(type III secretionsystem)的致病关键作用。与Psa3菌株M228相比,M227对两个主栽猕猴桃种(中华和美味猕猴桃)的枝条、叶片均表现为致病力显著减弱,激发非寄主烟草产生HR(hypersensitive response)的能力下降,且表现出生长缺陷。由于外泌蛋白是病菌侵染寄主的重要武器,本研究通过比较强弱致病菌株的外泌蛋白组解析M227致病力减弱的机制。强致病菌株M228和弱致病菌株M227共有61个差异显著的蛋白(number of unique peptides≥2,P<0.01),其中21个上调表达,40个下调表达。在40个显著下调表达的蛋白中,22个蛋白丰度差异超过1.5倍;下调1.5倍以上的蛋白中,15个为T3SS/T3Es(type III effectors)蛋白。这15个差异蛋白包括4个T3SS结构蛋白(harpin HopP1、translocator HrpK1、needle filament protein HrpA1和stator HrpE)、7个T3Es(HopI1、HopAE1、HopZ3、HopAU1、Eop3_like、HopAM1和HopQ1)与4个T3E伴侣蛋白(ShcF_AvrRpm1、ShcF_HopBB1-2、Tir_HopAL-like和ShcF_HopBB1-1)。这说明M227中T3SS的功能缺陷可能是其致病力显著降低的原因。通过构建Psa的T3SS-deficient突变体,发现T3SS为Psa致病及诱导非寄主HR所必需。进一步比较强弱致病菌株的全基因组发现了3个与T3SS相关的差异位点。通过基因替换发现,其中两个与M227的表型变化有关。其中,M227的Hfq蛋白缺失3个氨基酸(65VRP67);M228hfqM227、表现出与M227一致的生长表型,致病力显著、轻微降低;而M227hfqM228生长能力提高,但致病力与M227无差异。这说明,hfq差异位点影响Psa的生长和致病力,但不是决定M227致病力显著降低的因素。此外,基因替换发现T3SS差异位点显著影响Psa对不同猕猴桃品种的致病力和激发非寄主烟草HR的能力,但其作用机制未知。以上结果表明,T3SS差异位点通过未知机制影响T3SS相关蛋白的表达与外泌,造成了Psa致病力显著减弱和诱导烟草HR的能力下降。3)明确Psa T3Es repertoire,构建单、多基因突变体,并发现致病关键T3Es。为了明确T3SS参与致病的机制,本研究对Psa T3Es的致病功能进行了系统分析。首先,通过生物信息学分析和外泌蛋白组比较分析建立了Psa的T3Es repertoire,包括2个前期未发现的T3Es Eop3_like和HopAL_like;构建了陕西Psa3菌株M7和菌株M228的T3E单、多基因敲除突变体共91株,其中,单个菌株中最多敲除20个T3E基因。通过评价这些突变体对不同猕猴桃品种的致病力,发现:ⅰ)核心T3Es HopM1和AvrE1对致病力贡献稳定且显著(约50%),且两者具有不同的进化模式;ⅱ)可变T3E HopR1对Psa致病具有显著作用(贡献20-30%),与AvrE1/HopM1的致病功能非冗余;ⅲ)基因簇A、E和F中存在功能冗余T3E,其中E基因簇的HopZ5对Psa致病具有显著作用;ⅳ)特定T3E(如AvrRpm1、HopS2)对不同寄主品种的致病作用不同;ⅴ)部分T3Es(如AvrPto5、HopAZ1、HopQ1和HopAS1)的缺失反而导致Psa致病力提高。这为研究Psa T3E的致病作用、寄主选择作用以及T3Es之间的相互作用提供了研究基础。