第一部分肝胆道角蛋白的表达及原发性胆汁性肝硬化角蛋白基因变异的研究。 目的： 1) 了解肝胆道角蛋白的表达情况2) 探讨角蛋白基因变异与原发性胆汁性肝硬化的关系方法： 从10只1个月大的FVB/n小鼠(雌雄各5只)提取肝脏、胆总管、胆囊及小肠后用高盐提取(high salt extraction，HSE)和蛋白质印迹免疫(western blot)法分析角蛋白表达谱。 2) 提取来自意大利米兰的原发性胆汁性肝硬化病人(209例)和健康献血者(200例)外周全血基因组DNA，用K8/K18/K19全部外显予引物行递减聚合酶链反应(Touchdown PCR)扩增，扩增产物用变性高效液相色谱(denaturing high performanceliquid chromatography，DHPLC)分析，对有色谱峰改变的PCR产物经纯化后通过测序分析确定变异部位并分析变异位点在同类角蛋白和不同种属生物的保守性，最后经统计学分析确定角蛋白基因变异与原发性胆汁性肝硬化的关系。 结果： 1) 胆总管主要表达K8/K18/K19，也表达少量K7。肝脏、胆总管、胆囊、小肠均以K8表达为主，K18从肝脏到小肠依次减少而K19则相反。K20主要见于小肠，在胆总管仅见小量表达。本实验末见肝脏表达K7。 2) PBC组和对照组发现6个有意义的错义变异，包括K8 3个(G62C、R341H、V380I)、K18 1个(R411H)、K19 2个(G17S、V229M)。 3) 发现4个新的角蛋白变异，包括3个有意义的错义变异(K18 R411H、K19 G17S和K19 V229M)，1个同义变异(K19 N184N)，其中K19 V229M仅见于对照组。K19 G17S位于角蛋白结构的头部而K18 R411H位于的尾部，K19 G17S是首个发现的K19角蛋白有意义变异，而K18 R411H是首次发现位于K18尾部的变异。 4) 209例PBC中，能成功进行PCR扩增的有203例，有意义的错义变异17例，变异率为8.37﹪(17/203)，以K8 R341H最为频繁(47.1﹪，8/17)，其次是K8 662C(23.5﹪，4/17)，7例为单一杂合子变异，10例病人存在混合变异，即K18 R411H+K18S230T和K19 G17S+IVS2+38G→A混合变异各1例，全部(8例)K8 R341H变异均独特地伴随K8IVS7+lODel变异。对照组外显子变异4例，变异率为2﹪，内含子变异3例，全部(3例)K8R341H变异也伴随K8 IVS7+10Del变异。病例组与对照组角蛋白变异率有显著性差异(p=0.0059，OR=4.47，CI=1.48-13.56)。 结论： 1)肝胆道上皮细胞主要表达K8、K18、K19。 2)角蛋白基因变异伴随原发性胆汁性肝硬化，是发病的易患因素之一。 3)新发现的错义变异分别位于角蛋白的头部和尾部，K19 G17S是首个发现的K19角蛋白有意义变异，而K18 R411H是首次发现位于K18尾部的变异。 创新及意义： 1.首次分析小鼠胆总管角蛋白表达谱，发现胆总管主要表达K8/K18/K19，仅少量表达K7，该结果为研究角蛋白在胆总管的功能及其相关疾病提供了理论依据。 2.首次同时分析原发性胆汁性肝硬化病人3种角蛋白(K8/K18/K19)的全部编码基因，发现角蛋白变异伴随原发性胆汁性肝硬化，提示角蛋白变异是发病的易患因素。 3.发现2个新的角蛋白变异伴随原发性胆汁性肝硬化，即K19 G17S和K18 R411H，分别位于角蛋白主干结构的头和尾部，K19 G17S是首个发现的K19角蛋白有意义变异，而K18 R411H是首次发现位于K18尾部的变异。 第二部分角蛋白基因敲除或突变对胰腺腺泡细胞影响的动物实验研究。 目的：用无偏差的方法分析角蛋白基因敲除动物胰腺基因表达谱以揭示是否存在角蛋白功能性替代基因。 方法： 1.先用基因芯片分析(Microarry assay)缺乏角蛋白表达的12只K8裸鼠胰腺基因谱(用K8野生鼠作为参照)，并用实时逆转录多聚酶链反应(real time RT-PCR)方法验证所得结果。 2.根据基因芯片分析结果，针对改变明显的基因，选择具特异性的多肽序列免疫兔产生相应的抗小鼠抗体以检测蛋白的表达水平，设计相应引物以行PCR扩增或合成探针以检测mRNA的表达及分布。 3.对已建立的角蛋白缺失(K8或K8或K19裸鼠)、角蛋白丝异常(K18 R89C突变小鼠)、角蛋白磷酸化位点突变(K18 S33A、K18 S52A小鼠)等转基因动物，每一鼠系用2-4只小鼠，并用相应的正常鼠作为对照，通过用实时逆转录多聚酶链反应(real timeRT-PCR)、免疫印迹分析(Western Blot)等方法进一步分析基因芯片检测发现的有明显改变的基因在胰腺组织的表达。 4.用Balb/c小鼠、K8-null、K8-WT鼠建立两种急性胰腺炎模型，然后用原位杂交(insitu hybridization，ISH)、免疫印迹分析(western Blot)等方法分析基因芯片检测发现的有明显改变的基因在这些炎症组织的分布和表达。两种急性胰腺炎模型是分别由胆碱缺乏性饮食(choline-deficient diet，CDD)所诱导的坏死出血性急性胰腺炎和由雨蛙肽(caerulein)所诱导的间质水肿性急性胰腺炎，所用小鼠年龄和性别相匹配。CDD饮食诱导模型的建立是：21-25天大、14-19g重的雌性Balb/c小鼠禁食12-16小时后予正常饮食(对照组)或喂饲含0.5﹪乙硫氨酸(ethionine)的胆碱缺乏性饮食，3天后换成正常饮食。caertllelin诱导模型的建立是：予Balb/c小鼠、K8一null、K8-WT鼠禁食(不禁水)12-16小时后腹腔注射生理盐水(对照组)或50μg/kg caerulein，每小时1次共7次。在实验指定的时间点用CO<,2>吸入法处死动物取出胰腺，每一时间点含2只小鼠。 结果： 1) 与K8-WT鼠比较，K8-null鼠胰腺呈现代偿性基因谱改变，Reg家族基因上调，以胰岛源性再生因子-Ⅱ(regenerating islet-derived，Reg-Ⅱ)最明显。 2) Reg-TT是主要的胰腺腺泡细胞产物，除mRNA水平增加外，其蛋白水平也在K8-null鼠明显增加。 3) Reg-TT不仅在K8缺乏时上调，也在胞浆角蛋白丝缺乏(K18-null鼠)、胞浆角蛋白丝中断(K18 R89C)、K18$52A磷酸化定点突变的情况下被诱导。 4) Reg-Ⅱ在两种急性胰腺炎模型明显上调。 5) 在Reg家族中，Reg-TT呈选择性诱导，Reg-Ⅰ所受影响不如Reg-Ⅱ。 结论： 角蛋白缺乏或突变诱导胰腺腺泡细胞Reg-Ⅱ明显上调，提示Reg-Ⅱ可能功能性地补偿胰腺腺泡细胞缺失或异常的角蛋白，是角蛋白异常时激惹的一种替代反应产物以应对外分泌胰腺的损伤。 创新及意义： 1.产生的免抗小鼠Reg-Ⅱ抗体是首次报道的特异性识别Reg-Ⅱ的多克隆抗体，为Reg-Ⅱ的研究提供了有用的工具。 2.发现胰岛源性再生因子Ⅱ(Reg-Ⅱ)在胰腺外分泌细胞角蛋白缺乏、角蛋白丝中断、磷酸化位点异常时明显过表达，在角蛋白缺乏的急性炎症性损伤的胰腺组织表达更为显著，首次揭示了Reg-Ⅱ与角蛋白在胰腺组织的关系，提示Reg-Ⅱ可能功能性地替代异常的角蛋白以维护细胞结构和功能的完整以及应对组织的损伤，说明胰腺组织损伤时可能存在基因间相互调节的自我保护机制，胰岛源性再生因子的这种潜在性保护功能也为胰腺组织损伤的治疗提供了依据。