豚鼠是不同于大鼠、小鼠的实验动物,它具有相对较长的发情周期(16～19d)、较长的妊娠期(68d左右)和较少的排卵数(平均3.8个),是研究动物繁殖性状理想而珍贵的模型。本文应用基因克隆、免疫中和、RT-PCR等技术研究抑制素基因免疫对豚鼠卵泡发育的影响及豚鼠子宫LHR mRNA的表达差异。1.抑制素基因免疫对豚鼠抗体产生及卵巢的局部作用为研究抑制素基因免疫对豚鼠卵泡发育的影响,以含双拷贝抑制素(INHa(1-32))片段的基因疫苗pCISI对其进行免疫。将19只性成熟前的雌性豚鼠分为两组,实验组(n=15)于股四头肌三点注射pCISI质粒200μg/500μl,对照组(n=4)注射相同体积的生理盐水。免疫前24h于相同部位注射0.5%盐酸普鲁卡因100μl。间隔20d进行加强免疫,免疫剂量为100μg/500μ1,共加强免疫4次,末次免疫后发情周期的第8d乙醚麻醉后处死豚鼠,收集血样,采集卵巢及子宫称重。免疫期间,每隔10d采集血样,ELISA检测抗抑制素抗体水平。卵巢组织连续切片,HE染色统计各级卵泡数及黄体数。结果发现,pCISI免疫诱导豚鼠产生了抗抑制素抗体,加强免疫后提高了个体阳性率,但抗体水平并没有随免疫次数的增加而显著升高(P>0.05)。第二次免疫后实验组的抗抑制素抗体水平为1.90±0.14,而对照组为1.45±0.09；第三次免疫后实验组为1.56±0.17,而对照组为1.56±0.06；第五次免疫后的实验组为0.93±0.64,而对照组为0.30±0.40。卵巢各级卵泡数及黄体数的统计结果表明,pCISI免疫对卵泡发育无显著影响(P>0.05),未能引起性成熟前的豚鼠超数排卵。2.豚鼠子宫LHR mRNA表达的研究在豚鼠发情周期第0(排卵当天记为0d即DayO)、4(Day4)、8(Day8)、12d(Day12)及pCISI免疫后第8d(Day8(Imu))(?)将其麻醉处死(n=3)。以子宫组织总RNA为模板,参照猪、大鼠及小鼠LHR mRNA保守序列区设计引物,用反转录PCR方法扩增黄体生成素受体(LHR)基因,以PMD19-T vector为载体,转化大肠杆菌E.coli DH5a,筛选阳性克隆并测序,用BLAST及DNAman软件分析比对同源性。采用优化的半定量RT-PCR技术,以豚鼠的β-actin为分子内参,比较研究在发情周期不同阶段、抑制素基因免疫前后的豚鼠子宫组织中LHR mRNA表达量的差异。测序结果得到686bp的剪接变异体1和缺失75bp4号外显子的剪接变异体2。686bp序列与人类LHR mRNA序列同源性为83.8%,与牛、猪及绵羊LHR mRNA序列同源性分别为84.6%、84.2%及83.6%,而与大鼠和小鼠LHR mRNA序列同源性则分别高达93.7%和99.4%。LHR mRNA在豚鼠整个发情周期的子宫中均有表达,发情周期第0d的表达水平为0.635±0.0194,第4d为0.617±0.099,均显著低于第8d的表达水平(P<0.05),在第12d升至1.218±0.049。pCISI免疫之后的水平为0.766±0.080,与免疫前无显著性差异(P>0.05)。