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1990年Kitagawa等用沙土鼠全脑缺血模型,发现短暂性全脑缺血后再灌注能减轻随后较长时间的全脑缺血性损伤,进而提出了脑缺血预处理(ischemic preconditioning, IPC)及脑缺血耐受(ischemic tolerance,IT)的概念。然而缺血预处理固有的局限性,限制了在临床上的广泛应用。为此人们一直尝试寻找非缺血预处理的方法,如药物预处理方法诱导脑缺血耐受,希望为临床提供切实可行的脑保护措施。研究发现大鼠体内存在两种大麻素受体亚型(CB1和CB2)。CB1受体在脑组织中广泛表达,另外发现其也存在于部分外周组织中,包括脉管系统、心脏和肝脏等。既往研究表明CB2受体主要表达在免疫及造血细胞,目前更多的研究证实在脑、心肌、心血管系统及多种组织的内皮细胞均发现CB2受体的存在。大量研究证实并显示给予大麻素受体(CB1/2)激动剂WIN55,212-2,能减轻局灶性脑缺血和全脑缺血造成的脑损伤,对脑缺血损伤产生CB1受体依赖性的治疗和保护作用[1],但WIN55,212-2预处理是否能诱导脑缺血耐受,产生脑保护作用,尚未见文献报道。因此,本研究采用大脑中动脉栓塞(MCAO)致大鼠局灶性脑缺血模型,探讨大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理诱导脑缺血耐受的量效关系和时效关系,研究磷酸化ERK1/2在大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理产生的脑缺血再灌注损伤保护中的作用。实验一不同剂量WIN55,212-2预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用目的:研究不同剂量大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法:雄性SD大鼠50只,随机分为五组(n=10):对照组(Con组)于局灶性脑缺血前24h腹腔注射生理盐水0.3ml;DMSO组在局灶性脑缺血前24h腹腔注射与预处理组相同容量的二甲基亚砜;WIN55,212-2预处理组(WIN1～3组)分别在局灶性脑缺血前24h腹腔注射0.3、1和3mg/kg WIN55,212-2 (各剂量溶解于0.3ml DMSO)。采用大脑中动脉栓塞(MCAO)120min建立短暂局灶性脑缺血模型,所有大鼠在再灌注后24h,48h,72h进行神经功能评分(NFS),随后断头处死,取脑组织切片行TTC染色,确定脑梗死容积并计算梗死容积百分比。结果:(1)神经功能评分:WIN55,212-2预处理组大鼠NFS明显高于DMSO组和Con组(P<0.05);WIN2组和WIN3组的NFS明显高于WIN1组(P<0.05)。(2)脑梗死容积百分比:WIN55,212-2预处理组明显小于DMSO组和Con组(P<0.05);WIN2组和WIN3组的脑梗死容积百分比明显小于WIN1组(P<0.05)。而WIN2组和WIN3组组间比较无明显的统计学差异。结论:大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理对大鼠短暂性脑缺血损伤有保护作用,并具有一定的剂量依赖性,1mg/kg为预处理的适宜剂量。实验二重复WIN55,212-2预处理对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用目的:探讨不同次数大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理对大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤的保护作用。方法:雄性SD大鼠50只,随机分为五组:对照组(Con组)和DMSO组分别腹腔注射生理盐水0.3ml和DMSO0.3ml,1次/d,连续5d; WIN55,212-2预处理组(WIN1,WIN 3,WIN 5组),分别腹腔注射WIN55,212-2 1mg/kg(溶解于0.3ml DMSO),1次/d,重复给予1d、3d和5d。各组动物均在最后1次预处理后24 h,行大脑中动脉栓塞(MCAO)建立短暂局灶性脑缺血模型,并分别在MCAO后24h,48h,72h行神经功能评分(NFS),随后断头处死,取脑组织切片行TTC染色,确定脑梗死容积并计算梗死容积百分比。结果:(1)WIN55,212-2预处理组(WIN1,3,5组)大鼠NFS明显高于DMSO组和Con组(P<0.05),脑梗死容积百分比明显小于DMSO组和Con组(P<0.05)。(2)WIN5组大鼠NFS明显高于WIN1组和WIN3组(P<0.05),脑梗死容积百分比较WIN1组和WIN3组明显减小(P<0.05);而WIN1组和WIN3组的NFS和脑梗死容积百分比均无明显的统计学差异。结论:大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理的脑保护作用随着预处理次数增加其保护作用有所增强。实验三WIN55,212-2预处理对大脑内ERK1/2磷酸化水平和神经元凋亡的影响目的:研究大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理对大鼠短暂性局灶性脑缺血再灌注后磷酸化ERK1/2 (pERK1/2)水平和神经元凋亡的影响。方法:雄性SD大鼠24只,随机分为四组:假手术组(Sham组)即腹腔注射生理盐水0.3ml,1次/d,连续5d,不进行大脑中动脉栓塞(MCAO);对照组(Con组)、DMSO组和WIN55,212-2预处理组(WIN组)分别腹腔注射生理盐水0.3ml、DMSO 0.3ml和WIN55,212-2 1mg/kg(溶解于0.3ml DMSO),1次/d,连续5d。各组动物均在最后1次预处理后24 h,行大脑中动脉栓塞(MCAO)建立短暂局灶性脑缺血模型,并于再灌注4h处死大鼠,灌注取脑,制作石蜡包埋切片,用免疫组织化学和Western blotting的方法,测定大鼠脑组织ERK1/2水平的变化;用TUNEL法检测各组大鼠脑缺血再灌注后皮层神经元凋亡情况。结果:(1)TUNEL:与DMSO组和Con组相比,WIN组大脑皮层神经元细胞凋亡数目显著减少(P<0.05)。(2)免疫组织化学染色:与Sham组相比,WIN组,DMSO组及Con组的阳性细胞表达均有不同程度的增加,WIN组pERK1/2阳性细胞表达较DMSO组和Con组显著增强(P<0.05),而DMSO组和Con组比较无明显差异。(3)Western blotting结果:与Sham组相比,WIN组,DMSO组及Con组pERK1/2的表达水平均有所增强,WIN组pERK1/2的表达水平又较DMSO组和Con组明显增加,而DMSO组及Con组比较无显著性差异。结论:大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理上调pERK1/2表达,减少神经元凋亡。小结1.大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理能诱导脑缺血耐受,对大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤有保护作用。2.大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理对大鼠短暂性局灶性脑缺血损伤的保护作用具有一定的剂量依赖性,1mg/kg为预处理的适宜剂量;且重复多次预处理较单次预处理能产生更好的保护作用。3.大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理上调pERK1/2表达,减少神经元凋亡,表明磷酸化ERK1/2的激活参与了大麻素受体激动剂WIN55,212-2预处理诱导的脑缺血耐受。