分离式精子发生(Dissociated spermatogenesis)及其精子储存（Sperm storage）是动物在进化过程中为适应不同生存环境而形成的特殊生殖方式。虽然报道发现，一些季节性繁殖的鸟类、鱼类和爬行类动物具有分离式精子发生和精子体内长期储存现象，但是，由于缺乏有效的动物模型作为技术支撑和实验平台，分离式精子发生和精子储存的细胞分子机制研究一直未取得实质性进展。阐明分离式精子发生和精子储存机理是建立新的体外精子液态保存技术的重要突破点，也是动物生殖生物学论文研究的一个富含成果的领域。中华鳖(Pelodiscus sinensis)属于羊膜类变温爬行动物，具有重要的经济价值和药用价值，广泛分布于中国、日本和韩国等亚洲国家。前期研究证明，中华鳖精子发生属于典型的分离式模式，输卵管具有明显的精子储存现象，因此可作为研究分离式精子发生和精子储存机理的理想动物模型。　　本研究对中华鳖精子发生过程生精细胞凋亡进行透射电子显微镜(TEM)和DNA断裂的原位末端标记(TUNEL)检测，在细胞水平揭示凋亡与分离式精子发生的密切关系;对中华鳖睾丸进行RNA测序（RNA-Seq）和数字基因表达谱(DGE)分析，鉴定凋亡相关差异表达基因(DEG)并分析凋亡关键基因和蛋白在精子发生过程中的调控作用;对中华鳖输卵管进行RNA-Seq测序和分析，筛选参与精子储存的免疫、凋亡和自噬相关DEG，解析其参与输卵管精子储存的分子调控机制;检测精子储存过程中雄激素及其受体的动态变化，分析雄激素对输卵管精子储存的调节作用。研究结果以期在细胞和分子水平为分离式精子发生和精子储存的深入研究提供理论依据。主要研究结果如下:　　试验Ⅰ中华鳖精子发生过程中生精细胞的凋亡应用光镜技术对中华鳖精子发生不同阶段生精上皮的形态特点进行观察;TEM和TUNEL染色技术对自然生精周期中生精上皮凋亡情况进行超微结构和组织学检测。结果显示，中华鳖生精上皮显微结构呈现显著的季节性变化。4月份，精子发生处于静止期，生精上皮由2～3层精原细胞构成，上个生精周期残留的精子细胞和精子散乱分布于生精小管管腔中;7月份，精子发生进入活跃期，生精上皮形成由基底部向管腔呈放射样排列的精子柱，生精小管管腔中有少量散在的精子存在;10月份，精子发生进入后期，生精上皮主要由精子细胞构成，生精小管管腔中出现大量散在的精子。TUNEL法标记的大量凋亡生精细胞出现在4月，主要集中于上个生精周期残留下来的精子细胞和精子。精子发生中期和后期（7月、10月），凋亡细胞数量急剧下降，只有少量的精母细胞和精子细胞出现凋亡。电镜下所见凋亡生精细胞形态主要包括:核染色质凝集呈新月形或块状出现在核周边;细胞体积变小，与周围细胞明显分离;胞质内出现空泡且偶见体积很小双层膜包裹的凋亡小体。上述结果提示，细胞凋亡可能是清除中华鳖睾丸内季节性残余生精细胞的一项重要机制。　　试验Ⅱ中华鳖精子发生过程中凋亡差异表达基因鉴定与分析利用Illumina HiSeq2500测序平台对中华鳖精子发生不同阶段（4月、7月、10月）睾丸样品进行RNA-Seq测序和DGE分析。结果显示，三个文库共鉴定到4，622（2，514条上调表达，2，108条下调表达）、4,572（2,555条上调表达，2，017条下调表达）和380（163条上调表达，217条下调表达）条DEG。Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析鉴定到42个DEG参与凋亡通路和p53信号通路。一些关键抗凋亡基因（如Bcl-2、BAG1、BAG5）在中华鳖精子发生中期和后期显著上调表达。进一步利用JC-1荧光探针、免疫组织化学(IHC)和Western blot等技术对线粒体膜电位和关键凋亡蛋白进行表达模式验证分析，结果显示，7月和10月线粒体膜电位显著升高，促凋亡蛋白Cleaved caspase-3和线粒体CytC释放显著降低。以上结果提示，凋亡相关基因在分离式精子发生过程中发挥重要调控作用，p53信号通路CytC-Caspase途径参与了中华鳖精子发生过程中生精细胞的季节性凋亡。　　试验Ⅲ免疫、凋亡和自噬参与中华鳖输卵管精子储存的分子调控机制应用光镜和TEM技术对中华鳖输卵管精子储存现象进行组织学和超微结构检测。发现冬眠期（11月至次年4月）精子主要储存在输卵管阴道部、子宫部和峡部，储存的精子穿插在纤毛间并与上皮细胞接触紧密。在此基础上，采用Illumina HiSeq2500测序平台对繁殖期（7月，无精子储存）和冬眠期（1月，有精子储存）中华鳖输卵管样品进行RNA-Seq测序和DGE分析，结果显示，两个文库共鉴定到2，662个DEG，包括1，224个上调表达和1，438个下调表达基因。功能富集分析显示所鉴定DEG主要参与免疫反应、凋亡通路和自噬调节过程。进一步利用RT-qPCR、酶联免疫吸附测定(ELISA)、IHC和Western blot等技术对精子储存关键基因和蛋白进行表达模式验证。精子储存期，TUNEL分析显示输卵管凋亡细胞数量显著下降;IHC和TEM分析发现与储存精子接触紧密的输卵管上皮细胞发生明显自噬现象。上述结果在分子水平上揭示，免疫反应、凋亡通路和自噬调节参与中华鳖输卵管精子储存的季节性调控。　　试验Ⅳ雄激素及其受体调控中华鳖输卵管精子储存机理研究利用ELISA技术检测冬眠期（11月至次年4月，有精子储存）和繁殖期（7月，无精子储存）雌性中华鳖外周血雄激素水平变化规律。结果显示，精子储存期睾酮和双氢睾酮浓度显著升高。IHC分析显示雄激素受体(AR)主要分布在纤毛细胞的纤毛以及腺细胞的细胞质中。利用Western blot和RT-qPCR技术检测发现,AR蛋白和mRNA相对表达量在精子储存期显著升高。进一步应用氟他胺（雄激素拮抗剂）皮下注射雌性中华鳖抑制雄激素活性，反向验证雄激素对精子储存的调节作用，结果显示:外周血雄激素水平显著降低，输卵管凋亡水平上调，而且储存在内的精子数量显著下降。以上结果提示，雄激素通过调控输卵管细胞凋亡从而调节精子长期储存。