【摘 要】
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背景2019年12月新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的出现及迅速蔓延对人类健康构成了严重威胁,给各国医疗卫生系统带来了严峻的挑战,在全球范围内造成了前所未有的影响。SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域（RBD）是病毒入侵宿主细胞过程中的关键蛋白,开发靶向RBD的单克隆抗体是关键的抗病毒策略之一。目的构建抗SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的单链抗体（sc Fv）噬菌体展示文库,筛选特异性的
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背景2019年12月新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的出现及迅速蔓延对人类健康构成了严重威胁,给各国医疗卫生系统带来了严峻的挑战,在全球范围内造成了前所未有的影响。SARS-CoV-2刺突蛋白的受体结合域（RBD）是病毒入侵宿主细胞过程中的关键蛋白,开发靶向RBD的单克隆抗体是关键的抗病毒策略之一。目的构建抗SARS-CoV-2刺突蛋白RBD的单链抗体（sc Fv）噬菌体展示文库,筛选特异性的anti-RBD sc Fv基因,将其分别克隆到原核和真核表达载体,体外表达并纯化anti-RBD sc Fv,最后对其生物学功能进行鉴定。方法从重组RBD蛋白免疫的小鼠脾细胞中提取RNA,逆转录PCR扩增出总抗体的轻、重链可变区基因（VL、VH）簇,通过重叠延伸PCR（SOE-PCR）将VL和VH连接并扩增出sc Fv基因簇,插入噬菌体载体,经体外组装后获得原代sc Fv噬菌体展示文库。对原代sc Fv噬菌体文库进行多轮扩增与淘选,筛选出与RBD蛋白结合能力强的sc Fv单克隆噬菌体;通过基因测序验证sc Fv序列的完整性与正确性,并将其克隆到原核和真核表达载体进行体外重组表达与纯化;通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫印迹实验（Western Blot）鉴定体外表达的sc Fv与RBD蛋白的结合能力;表面等离子体共振（SPR）测定sc Fv与RBD的亲和力;假病毒中和实验检测sc Fv的中和能力;多肽ELISA鉴定sc Fv识别的RBD抗原表位,计算机预测sc Fv的三维结构并通过分子对接预测其与RBD的相互作用界面。结果本研究扩增得到了完整的sc Fv基因序列,以此构建的sc Fv噬菌体文库滴度为6.0×1011 pfu/m L,多轮生物淘选后获得4株与RBD蛋白结合较强的sc Fv基因序列。对这4株sc Fv进行体外表达与纯化,结果显示,在真核表达系统中,融合了抗体Fc段的sc Fv在真核表达载体中信号肽作用下以可溶性的分泌蛋白形式存在,但是表达量较低;在原核表达系统中,融合了His标签的sc Fv以包涵体的形式高表达,经过包涵体复性纯化,可获得纯度较高的可溶性sc Fv重组抗体。对原核表达的sc Fv生物学功能进行验证,结果表明4株sc Fv与野生型RBD有强特异性结合,与Omicron突变株RBD的结合相对较弱;同时对表达SARS-CoV-2不同突变株S蛋白的细胞裂解液进行检测,结果显示3株sc Fv可特异性识别包括Delta和Omicron在内的多个突变株S蛋白,其作为Western Blot一抗的效果优于一商品化的sc Fv-h Fc;SPR结果表明sc Fv与RBD蛋白的亲和力极高;中和实验则显示sc Fv对于阻断ACE2与假病毒结合的能力有限;多肽ELISA表明sc Fv主要识别RBD表面两段空间位置相邻的多肽;分子对接显示sc Fv和ACE2与RBD的结合界面不完全重叠,有助于解释sc Fv中和能力较差的原因。结论本研究成功构建了抗SARS-CoV-2 RBD的sc Fv噬菌体展示文库,通过该文库筛选并制备出能够与RBD特异结合的sc Fv重组抗体,进行了生物学活性研究,为进一步开发抗新冠病毒的药物和检测试剂提供了新的可能。
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