一、背景和目的: 术后假体感染是关节置换术后的灾难性并发症，常引起关节的疼痛和病废，以致手术完全失败，需要行翻修术，个别病例甚至需要截肢，给患者带来巨大的生理、心理痛苦和经济负担。假体感染的发病率约为4-12％，翻修再感染率约为4-16％，仍然是目前临床最棘手的问题，而且随着接受人工关节置换术的患者的增加，因假体感染而需接受治疗的患者也将有增无减。明确假体是否存在感染，对治疗方案的确定和治疗效果的优劣有着关键性的影响，但目前临床工作中，假体感染的诊断和治疗非常困难，尤其是对慢性低度深部假体感染的诊断。 Toll样受体(Toll—like receptors，TLRs)是一类介导天然免疫的跨膜信号传递受体家族，识别病原相关分子模式(Pathogen—associated molecular patterns，PAMPs)，是联系天然免疫和获得性免疫的桥梁。在宿主抗微生物反应中起着重要作用。Toll样受体首次发现时被认为是果蝇基因，1997年发现了第一个与果蝇Toll蛋白同源的人Toll样受体，也就是现在所说的Toll样受体4(Toll like receptor4，TLR4)。迄今为止，在哺乳类动物中10种TLRs分子和一种TLR同种体(RP105)TLRs已经被鉴定。TLRs属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，在免疫细胞中广泛表达，如：单核—巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞和B细胞。它由3个功能区组成：胞外区、跨膜区和胞内区。胞外区由十几至二十几个串联的富含亮氨酸的重复基序(Leucine rich repeats，LRRs)组成，这种结构可以加强蛋白质之间的粘附，与病原体及其产物的特异性识别有关，胞内段由Toll同源结构域(Toll homology domain，THD)和分子梭基端长短不同的短尾肽(0-22个氨基酸)组成。TLRs的几种配体已经确认，TLR1，TLR2，TLR6被脂肽如Pam3Cy5激活，TLR3被双链RNA(double—stranded RNA，dsRNA)激活，TLR4被脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)激活，TLR5被鞭毛蛋白激活，TLR7，8被单链RNA(single—stranded RNA，ssRNA)激活，TLR9被细菌或病毒的未甲基化的CpGDNA激活。TLRs识别内、外源性配体后，启动炎性应答信号通路，上调主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex，MHC)和CD80、CD86等共刺激分子(Costimulatory molecules，CM)表达，分泌肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor—α，TNF—α)、白介素6(interieukin6，IL—6)等细胞因子而对机体组织产生保护或损伤作用，TLR4介导细菌LPS引起的的活化和释放多种前炎症因子中起重要作用。从被发现至今，TLRs就一直是免疫学界的研究热点。TLRs在宿主抗微生物反应中起着重要作用。 众所周知，关节置换术后假体感染是难诊断、难治疗的细菌在关节深部假体表面生物膜内感染的疾病。反复或持续的难以根治的感染作为关节置换术后感染的特点，它促使我们探讨TLRs及其介导的天然免疫在关节置换术后感染中的作用。我们假定关节置换术后感染后TLRs在外周血白细胞的表达有变化。鉴于此，我们从以下两方面进行了研究，初步探讨TLRs在关节置换术后患者中的表达变化：1)TLRs在关节置换术后患者中的表达；2)TLRs在关节置换术后感染动物模型中的表达。 二、材料和方法: 1.临床实验：TLRs在关节置换术后患者外周血白细胞中的蛋白表达选取11例因非类风湿性疾病行关节置换的患者和同期的10例行关节镜检测患者，分别于入院时和手术后第3天早晨空腹抽取肘静脉血4ml，2ml用ELISA法检测IL—β，IL—6和TNF—α；另2ml用流式细胞术对TLRs作外周血白细胞的表达分析。组间同一指标比较采用单因素ANOVA方差分析，同组内同一指标术前术后变化水平比较采用自身配对t检验。 2.动物实验：TLRs在关节置换术后感染动物模型外周血白细胞中的蛋白表达为分析关节置换术后感染下的TLRs表达情况，构建了昆明小鼠的简易右膝关节置换术后表皮葡萄球菌感染模型。然后将动物实验分为：A组(假体置换术后感染组)、B组(假体置换术后无感染组)、C组(关节内注射细菌组)和D组(关节内注射生理盐水的对照组)。分别于实验后的第1、3天每组各对8只小鼠眼球取血0.2ml，流式细胞术对TLRs作外周血白细胞的表达分析；取血后处死并取右膝关节及周围组织3块作细菌培养，有2块以上组织出现表皮葡萄球菌阳性，则可判定为阳性，同时记录各组标本感染例数。对各组各时相TLRs的表达水平结果进行统计分析，组间同一指标比较采用单因素ANOVA方差分析，同组内同一指标术前术后变化水平比较采用自身配对t检验。 三、结果: 1.临床实验：TLRs在关节置换术后患者外周血白细胞中的蛋白表达关节置换组患者的术后IL-1β表达高于术前，P=0.026，各种TLRs蛋白均主要表达于外周血单核细胞，而在外周血淋巴细胞和中性粒细胞的表达率较低；TLR2、7在关节置换组患者术后外周血单核细胞阳性表达率明显高于术前，差异有统计学意义，P<0.05；而TLR4、9则无统计学差异，P>0.05；关节镜组TLRs术前术后组间的阳性表达率无统计学差异，P>0.05。对两实验组术前术后改变进行ANOVA方差分析，可知TLR2、TLR7、TLR9在关节置换组和关节镜组患者术前术后外周血单核细胞阳性表达率的差异具统计学意义，P<0.05：而TLR4则无统计学差异，P>0.05。这提示在无感染的情况下，手术本身的应激和局部损伤不影响TLRs的表达，但假体的植入则上调外周血对TLR2、TLR7、TLR9的表达。 2.动物实验：TLRs在关节置换术后感染动物模型外周血白细胞中的蛋白表达术后感染组，第一天TLRs的表达除TLR7(P=0.158)外均具有显著的统计性差异，P<0.05；而第三天和第七天，TLRs的表达均无无统计学意义，P>0.05。这表明小鼠在无假体植入的情况下发生感染，TLRs在初期均有变化，后快速下降。 综合临床和动物实验的结果，可认为在无临床感染的情况下，对照关节手术置入假体和关节手术无置入假体，假体置入下调TLR2、TLR7、TLR9的表达，但对TLR4的表达改变无统计学意义，在动物感染模型上，假体置入同样地影响TLR7、TLR9的表达，对TLR2、TLR4无影响。但对比四个实验组，各TLRs的表达水平比较均有非常显著的统计学意义，P<0.001。 四、结论: 临床实验证实，在蛋白水平，关节置换术后患者TLRs表达高于术前，也高于关节镜组患者，初步提示TLRs及其介导的天然免疫应答在假体植入中具有一定的作用，同时上调IL—6、IL-1β的表达水平。 动物实验证实，在蛋白水平，关节置换术后动物TLRs表达高于空白对照组，关节置换术后感染动物TLRs表达也高于关节置换术后无感染动物，初步提示TLRs及其介导的天然免疫应答在人工关节置换术后假体感染中具有一定的作用。 综上所述，TLRs及其介导的天然免疫应答在人工关节假体植入后及假体感染中均具有一定的作用。