白地霉脂肪酶（Galactomyces geotrichum lipase,GGL）对中长链不饱和脂肪酸具有底物特异性,可广泛应用于洗涤、食品、饲料工业和油脂化工等领域。野生菌株由于产酶量低、活力差,不能满足工业需求。因此,通过基因工程技术和发酵优化策略实现脂肪酶的异源高效表达,对提高GGL的产量,实现其工业化应用起到重要推动作用。本论文主要包括5部分内容:1、从富含油污的土壤或水样中筛选分离出一株脂肪酶活力较高的菌株,应用ITS通用引物从该菌基因组里扩增出344 bp的ITS-rDNA序列,经Blast序列对比得知该菌株与Galactomyces geotrichum J8M-14（JN227034）有99%的同源性,结合生理生化特性和形态学特征鉴定为白地霉（Galactomyces geotrichum）,命名为Galactomyces geotrichum FZ-4。基本酶学性质研究表明:该菌株所产脂肪酶在pH 7.5和40℃的反应条件下,酶活性相对较高;45℃以下,pH 7.0-9.0范围内,该酶较稳定;在Ca²⁺和Mn²⁺存在的情况下脂肪酶活性有60%左右的提高,而在其他离子如Fe²⁺、Fe³⁺、Co²⁺、Na⁺和Zn²⁺存在时脂肪酶活性却有不同程度的降低;最适作用底物为对硝基苯酚棕榈酸酯（C16）。2、通过对NCBI数据库中Geotrichum sp.属脂肪酶基因进行同源序列比对,根据保守区设计简并引物,克隆脂肪酶GGL I全序列（No.KP143749）。利用生物信息学分析软件,预测了GGL I基因的信号肽序列以及其编码蛋白质的理化性质、结构和功能。研究表明,GGL I包含一个1692 bp的开放阅读框,编码563个氨基酸,前19位氨基酸为信号肽,相对分子量为60.44 kDa,等电点为5.39,与G.candidum BT107（ABD67166）有98%的同源性;为亲水性氨基酸,其蛋白定位于胞外、内质网和核糖体,无跨膜区;含有2条二硫键,多个糖基化位点及蛋白磷酸化位点;在酶学分类上属于转移酶,具有转运和结合功能;蛋白二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成;以单体形式存在,有盖子区覆盖在活性位点之上。3、野生型脂肪酶基因GGL I-wt含有将近9%的低频密码子,经P.pastoris表达系统表达后发酵液基本无活性。根据毕赤酵母偏好性进行密码子优化后,GGL I-op相比GGL I-wt GC含量降低7.8%,CAI值上升0.13,GGL I-op在P.pastoris表达系统中的表达量显著提升。构建了六种基因工程菌,分别为X33/Zα-ggl1-op、SMD1168/Zα-ggl1-op、GS115/9K-ggl1-op、SMD1168/9K-ggl1-op、X33/GAP-ggl1-op和SMD1168/GAP-ggl1-op,运用酶活检测平板和摇瓶发酵筛选到一株酶活力最高的菌株X33/Zα-ggl1-op-8,初始酶活力为150 U/mL。300 mL X33/Zα-ggl1-op-8转化子的发酵上清液通过10 kDa的超滤管超滤浓缩后,比活为519.69 U/mg,比原始酶比活提升1.26倍,回收率为84%;经过Ni柱亲和层析后,比活达1154.64 U/mg,比原始酶比活提升2.8倍,回收率为62.22%。4、通过RT-PCR对筛选到的GGL I-op重组子进行拷贝数测定,结果筛选到覆盖1-5个拷贝数的重组子,脂肪酶活力在3个拷贝数时达到最大,为147 U/mL。GGL I-op重组子在1-5个拷贝数水平上的脂肪酶活力分别为53 U/mL、121 U/mL、147 U/mL、106 U/mL和45 U/mL,酶活力随着拷贝数增加表现为先升高后降低。5、以X33/Zα-ggl1-op-8为初始菌株,当接种量2%,培养温度25℃,甲醇添加量1.5%,初始pH 7.0,装液量35 mL,发酵时间4 d时,酶活力最高,达278.3 U/mL,是初始酶活的1.9倍,蛋白表达量是初始的3倍。经发酵条件优化后酶活力是野生菌的17倍。酶学性质研究表明,GGL I最适pH为8.0,最适温度为35℃;在pH 7-9、20-45℃以内较稳定;Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Cu²⁺对酶活力有促进作用,而Fe²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Co²⁺则抑制脂肪酶活力;最适底物为对硝基苯酚辛酸酯（C8）。将重组菌目的蛋白在MALDI-TOF-TOF中进行蛋白质质谱分析,通过软件Mascot搜索数据库鉴定出重组菌表达的目的蛋白是GGL I,且重组GGL I存在糖基化。